мясо пептонный бульон приготовление

Приложение 4. Приготовление питательных сред

Приготовление питательных сред

Среды для определения общей бактериальной обсемененности

1. Мясо-пептонный бульон. Освобожденное от костей, жира и сухожилий говяжье или конское мясо пропускают через мясорубку и заливают холодной водопроводной водой из расчета 1 л воды на 500 г мяса. Смесь водопроводной воды с фаршем медленно нагревают до кипения и кипятят в течение 1,5 часов. Небольшое количество (до 5 л) можно кипятить на открытом огне, часто помешивая, чтобы не произошло пригорания частичек мяса. Большое количество лучше кипятить в котлах с паровой рубашкой. Для определения готовности мясной воды фильтруют сначала небольшое количество ее в пробирку через бумажный фильтр, если жидкость прозрачная, вода готова. Затем жидкость сцеживают через полотно, сюда же отжимают сок из вареного мяса, доливают кипяченой водой до первоначального объема, разливают в чистую посуду (колбы, бутылки) и стерилизуют 20 мин в автоклаве при температуре 120°С. Из полученной мясной воды готовят мясо-пептонный бульон. К 1 л мясной воды добавляют 10 г пептона, 5 г NaCl, устанавливают реакцию до рН 7,0-7,2, кипятят, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в чистую посуду и стерилизуют 20 мин в автоклаве при температуре 120°С. В случае выпадения осадка в мясо-пептонном бульоне его вторично фильтруют с последующей стерилизацией.

2. Мясо-пептонный агар. К мясо-пептонному бульону прибавляют 1,5% мелко нарезанного агара. Ставят на слабый огонь для растворения. Устанавливают реакцию до рН 7,0-7,2, кипятят 12-15 мин, фильтруют через вату, добавляют 1% глюкозы, разливают в колбы или пробирки, стерилизуют при температуре 120°С в течение 20 мин.

3. Сухой питательный агар выпускается Дагестанским научно-исследовательским институтом питательных сред.

Среды и реактивы для выявления бактерий кишечной группы

1. Концентрированная среда Эйкмана. В 1 л воды растворяют 100 г пептона, 50 г хлористого натрия, смесь нагревают до кипения, фильтруют, прибавляют 100 г глюкозы, устанавливают рН 7,4-7,6, разливают по 10 см3 в пробирки. Среду стерилизуют текучим паром 30 мин, считая с момента когда термометр покажет температуру 100°С. Стерилизация текучим паром должка производиться 3 дня подряд. В промежутках между стерилизациями среда должна находиться в помещении с температурой не ниже 16°С.

2. Среда Эндо. 100 см3 мясо-пептонного агара (рН 7,4) расплавляют на водяной бане, охлаждают до 70°С и прибавляют 1 г химически чистой лактозы, предварительно растворенной в небольшом количестве стерильной прокипяченной дистиллированной воде.

В отдельных пробирках приготовляют:

а) 2-3 см3 спиртового насыщенного раствора основного фуксина;

б) 10 см3 10%-ного водного раствора сернокислого натрия или 10 см3 20%-ного водного раствора кристаллического сернокислого натрия.

В стерильную пробирку отмеряют 1 см3 раствора фуксина и прибавляют раствор сернистокислого натрия до обесцвечивания фуксина. Приготовленную смесь вливают в растопленный агар, хорошо перемешивают (избегая образования пены) и разливают по чашкам.

Горячий агар имеет бледно-розовый цвет, при застывании становится бесцветным.

3. Сухая среда Эндо выпускается Дагестанским научно-исследовательским институтом питательных сред.

4. Среда Гисса. К 100 см3 дистиллированной воды добавляют 1 г пептона, 0,5 химически чистого хлористого натрия, 0,5 г углевода и 1 см3 индикатора Анредэ. Устанавливают рН 7,0. Среду разливают в пробирки по 5 см3 с поплавками и стерилизуют при 110°С 20 мин. Среда должна быть бесцветной или соломенно-желтого цвета без розового оттенка.

Можно использовать сухие среды Гисса: сухой препарат с индикатором ВР, глюкозой.

5. Индикатор Андредэ. К 100 см3 дистиллированной воды добавляют 0,5 г кислого фуксина и 16,4 см3 1%-ного раствора едкого натрия. Стерилизуют при 110-112°С в течение 5 мин и хранят в темноте.

6. Реактивы для окраски по Граму.

а) 1%-ный водный раствор метилового фиолетового

б) раствор йода по Бурке: 100 см3 дистиллированной воды, 2 г йодистого калия, 1 г йода.

в) 0,5%-ный водный раствор сафранина.

Среды для выявления плесеней

Агаризованное солодовое сусло. К 1000 см3 солодового сусла (7-8%) прибавляют 20 г расплавленного на водяной бане или в аппарате Коха агара. Смесь фильтруют через гигроскопическую вату или фильтровальную бумагу. Фильтрат разливают по стерильным колбам и стерилизуют 15 мин при температуре 115°С или 3 дня по 30 мин в аппарате Коха при температуре 100°С. Среду можно приготовить, используя вместо сусла солодовый экстракт.

Агаризованное солодовое сусло должно иметь рН 5,6-5,8.

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

Источник

Приготовление питательных сред

Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления мясо-пептонных сред используют мясной бульон, который получают следующим образом: 500 г мелко изрубленного свежего мяса без костей, жира и сухожилий заливают в эмалированной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50°С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 50—55°С. Мясо отжимают, экстракт процеживают через марлю со слоем ваты, кипятят 30 мин для свертывания коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз через марлю с ватой, второй — через бумажный фильтр). Фильтрат доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин (пробки колб закрывают сверху колпачками из бумаги). Ватные пробки должны быть плотными, так как они служат фильтром, препятствующим проникновению бактерий из воздуха после стерилизации.

Мясной бульон может быть использован в любое время для приготовления соответствующих сред. Если их готовят сразу, то предварительная стерилизация мясного бульона не требуется.

Нередко в лабораторных условиях мясной настой кипятят вместе с мясом, затем мясо отжимают. При этом бульон получается хорошего качества. При потребности в мясном бульоне особо высокой питательности во время настаивания мяса с водой добавляют немного пепсина и подкисляют бульон соляной кислотой. Пепсин способствует дополнительной гидролизации белковых соединений мяса, и в результате количество доступных бактериям питательных веществ возрастает. Мясо можно заменить мясным экстрактом (5 г на 1 л среды).

Для приготовления МПБ к 1 л мясного бульона добавляют 5—10 г пептона (первый продукт гидролиза белка) для повышения калорийности среды и 5 г поваренной соли для создания осмотической активности. Среду нагревают до растворения пептона, постоянно помешивая.

Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, приливая 20%-ный раствор Na₂CO₃ до посинения влажной красной лакмусовой бумажки. Дли проверки рН среды удобно использовать индикатор бромтимолблау: 1—2 капли его смешивают в фарфоровой чашке с каплей бульона. В нейтральной среде бромтимолблау — бутылочно-зеленый, в кислой — желтый, в щелочной — синий.

После установления рН среду снова кипятят 5—10 мин, и белки, свернувшиеся при изменении реакции среды, отфильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульона или осветлив его белком. Для этого свежий яичный белок взбивают с двойным по объему количеством воды и смешивают с охлажденным до 50 °С бульоном. Смесь кипятят, помешивая, на слабом огне 10 мин, затем фильтруют. Прозрачный мясо-пептонный бульон разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин.

Мясо-пептонный агар (МПА). К 1 л МПБ добавляют 15— 20 г агара. Среду нагревают до растворения агара (температура его плавления — 100 °С, затвердевания — 40 °С), устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na₂CO₃ и через воронку разливают в пробирки (приблизительно по 10 мл агара столбиком для последующего разлива по чашкам Петри и по 5 мл для получения скошенного агара — косяков).

При разливе агара необходимо следить за тем, чтобы края пробирок оставались сухими, иначе пробки прилипнут к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120 °С 20 мин.

Мясо-пептонная желатина (МПЖ).В 1 л МПБ помешают 100—150 г желатины. Температура плавления желатины зависит от ее содержания в среде: в случае 10%-ной концентрации в среде она плавится при 24 °С; в случае 15%-ной — при 25 °С. В летнее время среды готовят, добавляя 15% желатины.

После растворения желатины при осторожном нагревании устанавливают слабощелочную реакцию среды (как для МПБ и МПА), кипятят 5 мин, затем охлаждают до 40—50 °С. Взбитый, с небольшим количеством воды яичный белок вливают в охлажденную желатиновую среду, хорошо взбалтывают и снова нагревают. Среда после выпадения белков в осадок становится прозрачной. Ее фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр, разливают в пробирки и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром, прогревая среду 3 раза по 30 мин каждые 24 ч.

Пивное сусло и сусло-агар. Зерна ячменя замачивают в холодной воде и проращивают при 35 °С. После того как ростки станут вдвое длиннее зерен, последние высушивают до воздушно-сухого состояния (можно при слабом подогревании), получая солод. Для приготовления сусла солод крупно размалывают и смешивают с водой (250 г солода на 1 л воды). Для лучшего выделения фермента амилазы смесь подогревают при 57 °С до исчезновения реакции на крахмал (синего окрашивания с иодом). Пробы на осахаривание крахмала проводят в фарфоровой чашке в капле жидкости.

Сусло процеживают через вату, затем фильтруют через бумажный фильтр. Такое сусло содержит 10—20% сахара. Точное его содержание определяют по плотности раствора при помощи сахариметра. Сусло разбавляют водой до концентрации сахара 6—8% и стерилизуют 30 мин при 115 °С и давлении 0,5 атм. Готовое сусло можно получить на пивоваренном заводе.

Для приготовления сусло-агара к пивному суслу добавляют 2,5—3% агара, кипятят до расплавления, фильтруют через вату и стерилизуют при тех же условиях, как и пивное сусло.

Обезжиренное молоко. Для приготовления питательных сред используют снятое молоко, так называемый обрат, так как жир в молоке неблагоприятно влияет на рост некоторых микроорганизмов. Обрат получают сепарированием молока, нагретого до 34 °С. Можно удалять жир и при отстаивании молока.

При стерилизации следует помнить о том, что молоко нельзя длительное время выдерживать в автоклаве, так как лактоза (молочный сахар), содержащаяся в молоке, может карамелизоваться.

Обезжиренное молоко разливают в стерильные пробирки и выдерживают при 115 °С (давление 0,5 атм) 10 мин. Перед стерилизацией кислотность обрата не должна превышать 22° Тернера, иначе молоко свернется. После стерилизации его выдерживают 3 сут в термостате при 30°С. чтобы спровоцировать развитие спорообразующих и других стойких к нагреванию форм. Через 3 сут пробирки с молоком просматривают и те, в которых развились микроорганизмы, выбраковывают.

При стерилизации в автоклаве иногда возможно побурение молока вследствие карамелизации молочного сахара и пептонизании казеина. При длительной стерилизации на дно пробирки выпадает осадок казеина, который может частично пептонизироваться. Перегретoe побуревшее молоко в качестве среды использовать нельзя.

Дрожжевые среды. Дрожжевая вода. 50—100 г сухих дрожжей разводят в 1 л воды, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение 3 дней ежедневно.

Дрожжевой автолизат. 200 г прессованных дрожжей разводят в 1 л воды; добавляют 2 г Na₂HPO₄, каплями I н. раствор NaOH (до рH 6,1) и 5 мл хлороформа, выдерживают при 37 °С 2 сут, доводят раствором NaOH до рН 7,4, кипятят 30 мин. фильтруют через бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют при 115 °С 30 мин.

Дрожжевой экстракт. 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 л воды, смесь кипятят 1 ч, трижды отфильтровывают через бумажный фильтр и стерилизуют при 115 °С 30 мин.

Бобовый отвар. 50 г фасоли (лучше белой) заливают 1 л водопроводной воды и варят до готовности так, чтобы бобы не разварились. Полученный отвар фильтруют через вату, добавляют к нему 10 г сахара и доводят до первоначального объема. Устанавливают слабощелочную реакцию среды, разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве 30 мин при давлении пара 1,5 атм.

1 По системе СИ давление принято выражать в паскалях (Па): 1 атм = 1,01325 х 10 5 Па = 0,1 МПа.

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Источник

Мясо пептонный бульон приготовление

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

БУЛЬОН МЯСО-ПЕПТОННЫЙ (ДЛЯ ВЕТЕРИНАРНЫХ ЦЕЛЕЙ)

Nutrient media. Meat-pepton broth (for veterinary). Specifications*

* Наименование стандарта. Измененная редакция, Изм. N 1.

Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 9 апреля 1975 г. N 899 срок действия установлен с 01.01.1976 г. до 01.01.1981 г.*

ПЕРЕИЗДАНИЕ. Август 1975 г.

Изменение N 1 внесено изготовителем базы данных по тексту ИУС N 11, 1989 год

Настоящий стандарт распространяется на мясо-пептонный бульон, представляющий собой питательный раствор, предназначенный для выращивания микроорганизмов.

1. ТЕХНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ

1.1. Мясопептонный бульон должен изготавливаться в соответствии с действующим технологическим регламентом из мясной воды по ГОСТ 20729-75 с добавлением 1% пептона и 0,5% хлорида натрия в разведениях 1:1, 1:2 и 1:4.

1.2. Мясо-пептонный бульон по физико-химическим, биохимическим и биологическим показателям должен соответствовать требованиям и нормам, указанным в табл.1.

Норма для разведений

Специфический, свежего мясного экстракта и пептона

Наличие механической примеси, плесени, хлопьев и осадка

Массовая доля общего азота, %, не менее

Массовая доля азота, аминогрупп, аминокислот и низших пептидов, %, не менее

Массовая доля пептонов, %, не менее

Массовая доля сухого вещества, %, не менее

Массовая доля белка, %, не более

Массовая доля хлористого натрия, %

Концентрация водородных ионов (рН)

Посев на питательные среды не должен давать роста микрофлоры в течение 3 сут в термостате при 37-38 °С

Способность поддерживать рост микробов, оптическая плотность, не менее, для

Staphylococcus aureus «Лоссманов»

Escherichia coli штамм 675

Streptococcus faecalis штамм 6783

1.1, 1.2. (Измененная редакция, Изм. N 1).

2. ПРАВИЛА ПРИЕМКИ

2.1. Мясо-пептонный бульон сдают и принимают сериями.

2.2. Каждая серия мясо-пептонного бульона на предприятиях биологической промышленности Министерства сельского хозяйства СССР должна быть принята государственным контролером Всесоюзного государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства СССР.

2.3. Под серией следует понимать любое количество мясо-пептонного бульона, изготовленное за один технологический цикл, в одной емкости (реакторе) и оформленное одним документом о качестве.

Если вся серия мясо-пептонного бульона расфасована в бутыли, делают выборку в количестве одной бутыли. Если мясо-пептонный бульон расфасован во флаконы, составляют выборку такого количества флаконов, чтобы объем мясо-пептонного бульона в отобранных флаконах соответствовал указанной выше норме, которая установлена в зависимости от общего объема серии мясо-пептонного бульона.

2.5. При получении неудовлетворительных результатов испытаний хотя бы по одному из показателей серию мясо-пептонного бульона считают не соответствующей требованиям настоящего стандарта.

2.6. Контрольную проверку образцов по требованию потребителя проводит Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства СССР.

3. МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ

3.1. Методы отбора проб

3.1.1. Пробу мясо-пептонного бульона в количестве 2 или 0,6 л (в зависимости от объема серии препарата) отбирают из реактора или бутыли стерильно.

Пробу, отобранную от серии мясо-пептонного бульона объемом менее 50 л, в архиве не оставляют.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

3.2. Внешний вид, цвет, наличие механической примеси, плесени, хлопьев и осадка устанавливают, просматривая флаконы и бутыли с мясо-пептонным бульоном в проходящем свете, для чего флаконы встряхивают, переворачивая вниз пробками, а бутыли покачивают.

3.3. Запах мясо-пептонного бульона определяют в пробе органолептически.

3.4. Определение содержания общего азота

3.4.1. Аппаратура и реактивы

Для проведения испытания применяют:

колбу Кьельдаля вместимостью 50-100 см по ГОСТ 25336-82;

элемент нагрева (плитку, горелку);

пипетки на 1, 2, 5 см по ГОСТ 20292-74;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72;

кислоту серную по ГОСТ 4204-77, концентрированную и 0,1 н раствор;

натрия гидрат окиси по ГОСТ 4328-77, 30-33%-ный и 0,1 н растворы, приготовленные на предварительно прокипяченной дистиллированной воде;

перекись водорода по ГОСТ 10929-76;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67;

метиловый оранжевый, 0,1%-ный раствор.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

3.4.2. Проведение испытания

После охлаждения содержимое колбы переносят в колбу для отгона, добавляя 10-12 см дистиллированной воды. Полноту переноса проверяют по индикатору метиловому оранжевому. Последняя порция смывных вод должна остаться желтой.

В приемную колбу аппарата Кьельдаля наливают 20 см 0,1 н раствора серной кислоты и 2 капли индикатора Таширо. Индикатор Таширо готовят, растворяя 0,4 г метилового красного и 0,2 г метиленовой сини в 200 см 96%-ного этилового спирта.

Отгонную колбу присоединяют к холодильнику и парообразователю. Содержимое отгонной колбы нейтрализуют 30-33%-ным раствором гидрата окиси натрия по индикатору метиловому оранжевому. Отгон производят до тех пор, пока в приемной колбе соберется около 70 см раствора.

Содержимое приемной колбы титруют 0,1 н раствором гидрата окиси натрия до перехода окраски раствора от лилового к зеленому.

Одновременно ставят контрольный опыт на реактивы, для чего вместо мясо-пептонного бульона в колбу для минерализации берут 1 см дистиллированной воды.

3.4.3. Обработка результатов

Содержание общего азота в мясо-пептонном бульоне ( ) в процентах вычисляют по формуле

,

— поправочный коэффициент к титру 0,1 н серной кислоты;

— количество 0,1 н раствора гидрата окиси натрия, израсходованное на титрование испытуемой пробы, или в контрольном опыте, см ;

— поправочный коэффициент к титру 0,1 н раствора гидрата окиси натрия;

— количество мясо-пептонного бульона, взятое на анализ, см ;

Источник

Мясопептонный бульон (МПБ).

Смыв с поверхности

Для определения количества микроорганизмов на поверхности продукта пользуется проволочными мерками или металлическими шаблонами с ручкой разной площади /2х2см, 5х10см, 10х10см./. Мерку или шаблон опускают в спирт и затем обжигают над огнем для стерилизации. Приложив мерку или шаблон к исследуемой поверхности, стерильным влажным марлевым или ватным тампоном тщательно протирают ограниченную площадь. После этого тампон помещают в колбочку с определенным/мерным/количеством стерильной воды. Вторым сухим тампоном обтирают вновь ту же площадь и сбрасывают тампон в ту же колбочку.

Смыв с посуды

В посуду определенной емкости наливают 1л стерильной воды. Наклоняя посуду в разные стороны, обмывают этой водой всю внутреннюю поверхность в течение 5-10мин. После этого производят посев 1мл смывной воды в чашку и заливают его остуженным до 45*(градусов) мясопептонным агаром. Посев помещают в термостат на 48час. При температуре 30-37*. После этого подсчитывают выросшие колонии. Для перевода полученной величины на 1мл нормального наполнения посуды надо число колоний разделить на емкости посуды.

Смыв с рук

Заранее заготовляют и стерилизуют пробирки с опущенными в них на деревянной палочке или алюминиевой проволоке ватным тампонами. В пробирках должно быть 2-3мл воды и точно 10мл… Для определения общего количества микроорганизмов в 10мл стерильной воды опускают стерильный ватный тампон и скачивают его. Затем тампон вынимают, обмывают им пальцы, ладони и тыльные части обеих рук и помещают его обратно в стерильную пробирку с оставшейся стерильной водой. Ополаскивают тампон водой в течение 5мин. и отжимают.

Питательные среды

По форме различают жидкие и твердые(плотные) питательные среды. Твердые среды приготовляют из жидких путем добавления к ним 1,5-3% агара или 10-15% желатина.

Агар – коллоидное вещество, получаемое из некоторых морских водорослей. Представляет собой смесь углеводов (полисахарид). В водной среде агар плавится при температуре 90-100* и застывает при 40*. При застывании дает плотный гель, но выделяет конденсационную воду. Агар бактериологически индифферентен, однако чувствителен к кислотности среды. При стерилизации агара с рН ниже 5 происходит его частичный гидролиз и получается слабый гель.

Желатин – смесь белковых веществ животного происхождения. Его получают из кожи, сухожилий, костей. При нагревании с водой желатин образует коллоидный раствор, застывший при 18-20* в гель. При 25-37* гель переходит в золь. Желатин бактериологически не индифферентен. Микроорганизмы, обладающие протеолитическими ферментами, гидролизуют его (разжижают). Стерилизуют желатин дробной стерилизацией, так как высокая температура и повышенное давление вызывает его гидролиз и он теряет способность переходить из состояния золя в состояние геля.

Мясопептонный бульон (МПБ).

В 1 л мяс­ной воды растворяют при подогревании и помешивании 10 г пептона (1%) и 5 г (0,5%) хлористого натрия. Рекоменду­ется брать 3 части хлористого натрия и 2 части двузамещенного фосфорнокислого натрия. Смесь вводится в количестве 0,5%. Фосфорнокислый натрий стабилизирует реакцию сре­ды и служит дополнительным источником фосфора. Уста­навливают рН среды до 7,6—7,8, кипятят 30—45 минут до выпадения осадка.

Охлаждают, фильтруют через бумажный ф+ильтр, доли­вают водой до первоначального объема, проверяют рН.

Разливают по пробиркам, флаконам и стерилизуют 15— 20 минут в автоклаве при 120°С.

Концентрированный мясо-пептонный бульон готовят на особой мясной воде (1 кг мяса заливают 1 л воды). Такой бульон служит для выращивания анаэробных и других микробов.

Источник

Простые питательные среды

Мясопептонный бульон и мясопептонный агар являются пригодными для большинства бактерий наиболее простыми питательными средами. Исходным материалом для приготовления этих и ряда других питательных сред служит мясная вода, представляющая собой желтоватую прозрачную жидкость с кислой реакцией. Мясная вода содержит растворимые белковые вещества (альбумины), экстрактивные вещества и некоторые соли.

Мясная вода и концентрированный мясопептонный бульон (по ГОСТу 10444-63)

Мясо говяжье или конское после удаления костей, жира и сухожилий пропускают через мясорубку, и фарш заливают холодной водопроводной водой, вливая на каждые 500 г мясного фарша 1 л воды. После перемешивания смесь медленно нагревают до кипения и умеренное кипение поддерживают в течение 1,5 ч. Небольшое количество смеси фарша с водой (до 5 л) можно кипятить на открытом огне, часто помешивая, чтобы не произошло пригорания мелких частичек мяса.

Большое количество лучше кипятить в котлах с паровой рубашкой. Готовность мясной воды определяют фильтрованием небольшого количества ее в пробирку через бумажный фильтр. Если фильтрат прозрачен, мясная вода готова. Если же фильтрат получается мутным, то варку следует производить до тех пор, пока не получится вполне прозрачный фильтрат. После окончания варки жидкость отцеживают через полотно или вдвое сложенную марлю, отжимают из вареного мяса весь сок и полученную жидкость доводят кипяченой водой до первоначального объема. Добавления большого количества воды обычно не требуется, так как в результате варки в мясную воду переходит много сока из мяса. Только при слишком длительной варке и очень бурном кипении наблюдается большое выпаривание жидкости.

Полученную мясную воду разливают в стеклянные пол-литровые банки, закатывают и стерилизуют в автоклаве 20 мин при температуре 120 °С. Из заготовленной таким образом мясной воды по мере надобности приготовляют необходимые питательные среды.

Чтобы получить концентрированный мясопептонный бульон (МПБ), к 1 л мясной воды прибавляют 10 г пептона1 и 5 г хлористого натрия. Доводят реакцию среды до pH 7,0-7,2, кипятят, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в чистые пробирки и, закрыв ватными пробками, стерилизуют в автоклаве 20 мин при температуре 120 °С.

Разведенный мясопептонный бульон

Приготовление мясной воды производится так же, как и для концентрированного бульона, но вместо 500 г мясного фарша берется 250 г его на 1 л воды. Можно заготовленную концентрированную мясную воду развести вдвое водой. К 1 л разведенной мясной воды добавляют 5 г пептона, 2,5 г хлористого натрия, устанавливают pH 7,0-7,2, а далее поступают так же, как при приготовлении концентрированного мясопептонного бульона.

Рыбопептонный бульон

На заводах, вырабатывающих рыбные консервы, вместо мясной воды для приготовления сред можно пользоваться рыбной водой. Рыбную воду следует готовить из крупной тощей рыбы. Лучше всего для этой цели подходит судак, треска или щука. Освобожденную от костей и жира рыбу пропускают через мясорубку и заливают холодной водопроводной водой из расчета 1 л воды на 500 г рыбного фарша. Все дальнейшие операции приготовления рыбной воды аналогичны операциям приготовления мясной воды.

Рыбная вода используется для приготовления рыбопептонного бульона. На 1 л рыбной воды прибавляют 10 г пептона, 5 г поваренной соли, нейтрализуют до pH 7,0-7,2 и стерилизуют так же, как мясопептонный бульон.

Розлив бульона в пробирки (перед стерилизацией) производится через стеклянную воронку, на конец которой надета резиновая трубка с наконечником и зажимом Мора (рис. 52). Стеклянный наконечник следует несколько погружать при розливе в пробирку, чтобы края пробирки не смачивались бульоном, иначе ватная пробка присохнет к стеклу и может прорасти микроорганизмами.

Установление реакции питательных сред

Перед измерением pH стеклянным электродом производят корректировку шкалы pH по буферному раствору. Величина pH буферного раствора должна быть близка к pH исследуемого раствора. Температурный компенсатор прибора устанавливают на температуру буферного раствора и настраивают усилитель и потенциометрическую часть прибора по нормальному элементу. Затем, промыв дистиллированной водой электроды и измерительный сосуд, наполняют его исследуемой средой и производят измерение pH среды; устанавливая температурный компенсатор на температуру среды и нажимая кнопку для включения прибора на фронтальной доске рН-метра, замечают показания стрелки гальванометра на шкале pH. Подробно правила пользования, настройки и ухода за приборами описываются в инструкциях, прилагаемых к приборам. Длительность анализа 3-5 мин. Результаты достаточно точны.

Электрометрически с помощью рН-метра и иономера, очень удобно проверять pH готовых сред. А так как при изготовлении питательных субстратов для бактериологических анализов приходится не только фиксировать имеющийся уровень pH среды, но и доводить реакцию до определенного его значения, то в практике оказался более удобным колориметрический метод.

Перед стерилизацией pH среды доводят до необходимого уровня (7,0-7,2). Для этого в большую колбу (2-3 л) вливают 1,5 л приготовляемой питательной среды. Из бюретки в нее начинают приливать по каплям 10%-ный раствор двууглекислой соды или слабый раствор щелочи (например, 0,1 н. раствор едкого натра), все время проверяя реакцию среды по индикатору (в данном случае по бромтимоловому синему). Для этого на белую фарфоровую плитку (можно даже кафельную) наносят несколько капель среды, в которые добавляют каплю индикатора. Если бромтимоловый синий при этом даст желтую окраску, то приливание соды или щелочи нужно продолжать до тех пор, пока среда от капли индикатора не окрасится в салатово-зеленый цвет. Если в капле исследуемой среды при внесении индикатора появляется зелено-синий тон, то щелочной раствор при титровании прилит в избытке и в колбу со средой следует добавить свежую, еще не титрованную питательную среду и опять проверить реакцию.

После проверки реакции среды по лакмусу и подбора индикатора берут компаратор, устанавливают в него, пробирки и стандартные ампулы с соответствующим pH (рис. 55). Во вторую пробирку первого ряда (№ 2) в компараторе вливают 2 мл исследуемой питательной среды; сюда же добавляют 4 мл дистиллированной воды и 1 мл 0,3%-ного раствора избранного индикатора (обычно, как уже сказано, метанитрофенола). В две крайние пробирки первого ряда № 1 и 3 вливается по 2 мл питательной среды и по 5 мл дистиллированной воды. В среднюю пробирку второго ряда № 5 помещают только 7 мл дистиллированной воды. В два крайних гнезда второго ряда компаратора № 4 и 6 вставляются ампулы со стандартным раствором с показателями pH, в интервале между которыми устанавливается реакция среды.

Рассматривая пробирки на свет через нижнее отверстие в компараторе на фоне белой матовой пластинки, сравнивают окраску исследуемой жидкости с окраской индикатора. Если окраска в пробирке со средой совпадает с окраской индикатора в одной из ампул, то величина pH среды будет равна значению pH данной стандартной ампулы. Если же цвет исследуемой среды (во второй пробирке) окажется более светлым, чем в стандартной ампуле, то в пробирку со средой по каплям добавляют 10%-ный раствор двууглекислой соды или 0,1 н. раствор едкого натра, используя для этой цели микробюретку. Приливание нейтрализующих растворов по каплям продолжают до тех пор, пока цвет в пробирке не сравняется с цветом в одной из ампул. По количеству миллилитров соды или щелочи, израсходованной на нейтрализацию 2 мл среды (помещенных в пробирку № 2), нетрудно подсчитать, какое количество миллилитров нейтрализующего раствора потребуется для установления уровня pH во всем объеме приготовляемой питательной среды.

В очень кислых средах величину pH определяют с помощью индикатора пара-нитрофенола. Растворы применяемых индикаторов готовят следующим образом.

1. 0,3 г мета-нитрофенола растворяют в 100 мл дистиллированной воды (интервал значений pH от 6,8 до 8,4).

2. 0,1 г пара-нитрофенола растворяют в 100 мл дистиллированной воды (интервал значений pH от 5,4 до 7,0).

Установить приблизительное значение pH среды можно также с помощью универсального индикатора. Для этого в фарфоровую чашку наливают 2-3 мл исследуемой среды и приливают 2-3 капли универсального индикатора. Размешав смесь стеклянной палочкой, сравнивают ее цвет с окраской полос на цветной бумажной шкале. pH исследуемой среды будет такой же, какой указан у равноокрашенной полоски цветной шкалы. Степень точности определения pH универсальным индикатором около 0,5.

Приготовление мясопептонного агара (МПА)

Мясопептонный агар готовят из концентрированного мясопептонного бульона. В большую эрленмейеровскую колбу из тугоплавкового стекла емкостью до 2 л, снабженную ватной пробкой, вливают концентрированный мясопептонный бульон, добавляют от 2 до 4% (в зависимости от сорта) мелко нарезанного агара и, не закрывая пробкой, ставят на слабый огонь для расплавления.

Мясопептонный бульон нужно брать с реакцией среды 7,4, потому что при стерилизации pH снизится на 0,2. Реакцию мясопептонного агара можно установить после того, как произойдет полное расплавление. Если агар хорошего качества и не дает осадка, то после установления pH его кипятят 12-15 мин, фильтруют через вату и, разлив в колбы или пробирки (в зависимости от надобности), стерилизуют в автоклаве 20 мин при 120 °С.

Если агар недостаточно очищен, он может дать осадок. В этом случае до стерилизации мясопептонный агар следует осветлить. Для этого к расплавленному и охлажденному до 50 °С мясопептонному агару прибавляют яичный белок, смешанный с 30 мл воды и взбитый до состояния пены. На 1 л среды берут белок одного куриного яйца. Агар тщательно взбалтывают с введенным белком и ставят в автоклав на 10 мин при 120°С. Во время кипения белок свертывается и увлекает с собой все взвешенные частицы. После автоклавирования агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Для этого берут стеклянную воронку большого диаметра, натягивают на нее марлю, а сверху кладут тонкий слой ваты. Фильтровать кипящий агар нужно быстро и фильтрат до застывания разлить в пробирки по 5-10 мл. Стерилизацию среды проводят в автоклаве, как указано выше.

После стерилизации пробирки со средой, содержащие по 5 мл агара, ставят в наклонное положение, так чтобы агар не касался пробки. После застывания получают «косой» (или скошенный) агар. Пробирки с 10 мл агара помещают в штатив и дают застыть, получая среду, разлитую на «высокий столбик». Косой агар хранить более 4-7 дней не рекомендуется, так как он высыхает.

Источник