мук по питательным средам

МУК по питательным средам

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Дата введения: с момента утверждения

1. Разработаны: Федеральным государственным учреждением науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (С.М.Суханова, Н.Е.Захарова, Э.И.Конду, И.А.Голубенко).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3).

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 18 января 2008 г.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания предназначены для работников организаций, осуществляющих:

— при экспертизе НД и

— при проведении внутрилабораторного контроля качества коммерческих питательных сред.

1.2. Настоящие методические указания распространяются на исследования бактериологических питательных сред отечественного и зарубежного производства.

2. Нормативные и методические ссылки

2.1. Государственная Фармакопея СССР XI издания. Вып.1, 2.

2.2. Методические указания по методам контроля МУК 4.1/4.2.588-96 «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям» /Минздрав России. М., 1998.

2.3. Санитарные правила СП 3.3.2.561-96 «Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов» /Минздрав России. М., 1998.

2.4. Санитарные правила СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности» /Госкомсанэпиднадзор России. М., 1996.

2.5. Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований: ГОСТ Р 51446-99 (ISO 7218-96).

2.6. Агар микробиологический: ГОСТ 17206-96.

2.7. Методические рекомендации «Определение сроков годности сухих микробиологических сред и питательных основ методом «Ускоренного старения» при повышенной температуре». Махачкала, 1987.

2.8. Водоросли морские, травы морские и продукты их переработки: ГОСТ 26185-84.

2.9. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. М., 1980.

2.10. Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред. М., 1977.

2.11. Методические указания «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»: МУК 4.2.1890-04.

3. Общие положения

3.1. Целью введения настоящих методических указаний является регламентация стандартных методов контроля бактериологических питательных сред.

3.2. Методические указания содержат описание общих методов контроля бактериологических питательных сред. Особенности контроля качества сред, не охватываемые настоящим документом, должны быть описаны в нормативной документации на эти препараты.

4. Термины и определения

4.5. Оценка результатов. Определение положительного или отрицательного результата.

4.6. Разведение культуры. Величина, указывающая во сколько раз была разведена суспензия культуры (например, 10, 10 и т.д.) в отношении исходной, соответствующей 10 ед. по стандартному образцу мутности ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича (ОСО-42-28-85 П).

5. Общие указания при оценке качества питательных сред

I. Оценка качества питательных сред и их компонентов проводится с помощью совокупности показателей, выбираемых для контроля среды в соответствии с ее назначением, и включает:*

1. Контроль качества препарата по физико-химическим показателям.

* Используемые в лабораториях коммерческие питательные среды контролируются на предприятиях-изготовителях, поэтому внутрилабораторный контроль их качества проводят только в случаях:

Для внутрилабораторного контроля качества коммерческих питательных сред, контроль которых не предусмотрен действующими нормативными документами, необходимо проводить визуальную оценку качества, определять значение рН готовой среды, стерильность каждой приготовленной серии (см. р.7.1.1 «Контроль чистоты розлива»), а также оценивать качество среды с помощью контрольных штаммов.

2. Контроль специфической активности препарата по биологическим показателям.

Перечень показателей, необходимых для контроля основных групп питательных сред, приведен в прилож.1.

Готовую среду засевают культурой (тест-штаммом) того (целевого) микроорганизма, для которого приготовлена среда, и гетерологичных штаммов и визуально (или под малым увеличением микроскопа) изучают характер его роста. Рост микроорганизмов оценивают с помощью количественных (для плотных сред), полуколичественных или качественных методов*.

Для оценки результатов качественным методом определяют наличие и характер роста каждого из тест-штаммов. Рост целевых тест-штаммов должен быть типичным по цвету, размеру и морфологии колоний; рост нецелевых должен частично или полностью подавляться.

Для оценки результатов количественным методом при интерпретации ингибирующих, накопительных или задерживающих рост свойств среды, подсчитывают количество выросших колоний на тестируемой и контрольной (среде выращивания) средах.

Требования к специфической активности зарегистрированных в РФ бактериологических питательных сред и добавок перечислены в прилож.2.

III. Серия среды признается годной только после проведения всех видов контроля.

6. Определение физико-химических показателей

6.1. Общие указания для приготовления реактивов

Концентрация. При указании концентрации растворов в процентах, следует подразумевать весобъемные проценты. Например, для приготовления 10%-го раствора следует брать 10 г вещества на 100 мл готового раствора.

Точная навеска. Взвешивание на аналитических весах с точностью до 0,0002 г. Если не указано «точная навеска», то навеску берут с точностью до 0,01 г.

Оценка результатов. Результаты рассчитывают на основании не менее двух параллельных определений. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое значений результатов двух параллельных измерений. Допустимое отклонение от средней величины не должно превышать 10%.

Реактивы и титрованные растворы. Реактивы и титрованные растворы, приведенные в настоящих МУК, описаны в соответствующих разделах Государственной Фармакопеи СССР XI издания, вып.2, если нет других указаний.

Квалификация реактивов. Для анализа необходимо использовать реактивы квалификации хч и чда.

Хранение реактивов. Растворы реактивов хранят при температуре 18-20 °С в течение 6 мес., если нет изменений их физических свойств или нет других указаний.

Контрольный опыт (контроль на реактивы). Под контрольным опытом подразумевают определение, проводимое с тем же количеством реактивов и в тех же условиях, но без испытуемого препарата, вместо которого используют растворитель.

6.2. Описание препарата

Внешний вид препарата определяют визуально, указывая:

* При описании цвета оттенок указывают перед основным цветом (например, «желтовато-коричневый»).

6.3. Определение растворимости

Количество препарата (г), необходимое для приготовления конкретной серии питательной среды, должно растворяться при перемешивании и, если необходимо, при кипячении в течение 2-3 мин.

Препарат считают растворившимся, если в растворе при визуальном наблюдении в проходящем свете не обнаруживаются частицы вещества.

Для препаратов, образующих при растворении мутные растворы, соответствующее указание должно быть приведено в нормативной документации и инструкции по применению.

6.4. Определение прозрачности и цветности

Прозрачность и цветность сухих препаратов определяется визуально в проходящем свете в растворе после фильтрации его через ватно-марлевый фильтр (агаровые среды) и бумажный фильтр (жидкости) (подготовку образца см. раздел 6.3 «Определение растворимости») (см. примечание раздела «Описание препарата»).

Прозрачность и цветность готовых сред, разлитых во флаконы, определяют визуально в проходящем свете. Агары предварительно расплавляют в кипящей водяной бане и разливают в чашки Петри слоем 4-5 мм.

Раствор препарата, а также готовая среда могут быть либо прозрачными, либо с незначительной опалесценцией, либо непрозрачными.

После приготовления среды из сухого препарата (стерилизации, розлива в чашки Петри, пробирки и подсушивания) показатель прозрачности и цветности указывается также и для готовой среды.

6.5. Определение рН

Определение рН питательных сред проводят потенциометрическим методом с применением стеклянного электрода.

Калибровка и проверка рН-метра (потенциометра). Подготовка рН-метра и электродной системы производится согласно инструкциям, прилагаемым к прибору. Перед работой на потенциометре необходимо, пользуясь стандартными буферными растворами со значениями рН 4,01; 6,86; 9,18 при 25 °С, провести калибровку прибора*. Для приготовления таких растворов могут быть использованы фиксаналы (ГОСТ 8.135-74**). Различие между показанием прибора и номинальным значением рН буферного раствора не должно превышать 0,04 единицы рН.

* Если рН контролируемого раствора отличается менее чем на единицу от рН стандартного буферного раствора, то достаточна проверка прибора по одному буферному раствору, величина рН которого лежит в том же диапазоне измерения, что и значения рН контролируемого раствора. Если рН контролируемых растворов находятся в широких пределах, то проверку рН-метра следует производить по двум (трем) стандартным буферным растворам в соответствии с инструкцией.

При измерении рН контролируемых растворов отсчет величины рН по шкале прибора производят после того, как показания прибора примут установившееся значение. Время установления показаний определяется буферными свойствами и температурой раствора (обычно время установления показаний не превышает 2 мин). Определение рН проводят при (25±2) °С, в противном случае необходимо сделать соответствующие поправки (подвести ручку термокомпенсатора либо использовать коэффициент пересчета). При измерении рН агаровых сред следует иметь ввиду, что полученные значения рН являются условными.

Оценку значения рН питательных сред необходимо проводить с учетом последующей стерилизации.

Примечание: автоклавирование, как правило, приводит к снижению рН, поэтому перед стерилизацией рН среды повышают на 0,2 единицы от требуемой величины, а после автоклавирования реакцию среды проверяют повторно.

Метод измерения рН

6.6. Определение белка

Реактивы: 20%-я трихлоруксусная кислота.

Ход определения

К 5 мл 5%-го раствора анализируемого препарата добавляют равный объем 20%-й ССlСООН, тщательно перемешивают.

Помутнение раствора через 5 мин свидетельствует о присутствии в препарате следов белка.

6.7. Определение содержания пептидов по биуретовой реакции

Метод основан на способности пептидов давать цветную реакцию с биуретовым реактивом. Концентрацию пептидов («пептонов») определяют путем сравнения интенсивности окраски испытуемого и стандартного растворов.

Приготовление реактива А. Растворяют 1 г меди сульфата (CuSO·5НO) в нескольких миллилитрах воды. В этот раствор прибавляют 4,5 г натрия-калия тартрата, предварительно растворенного в 40 мл воды. Объем раствора доводят водой до 50 мл. Раствор годен к употреблению в течение дня.

2) 10%-й раствор натрия едкого;

3) 0,9%-й раствор натрия хлорида;

4) 1%-й стандартный раствор пептона (ГОСТ 13805-76).

Приготовление 1%-го стандартного раствора пептона. Стандартный раствор 1%-ного пептона готовят с учетом влажности при растворении навески в 0,9%-м растворе натрия хлорида. Реактив хранят в холодильнике. В качестве консерванта используют мертиолят (1:10000).

Приготовление контрольного раствора. К 5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида добавляют 0,5 мл 10%-ного раствора натрия едкого и 0,5 мл реактива А.

Построение калибровочной кривой. Из стандартного раствора готовят ряд разведений с содержанием пептона от 0,1 до 0,5% на 0,9%-м растворе натрия хлорида с интервалом 0,1%. К 5 мл каждого разведения прибавляют 0,5 мл 10%-го раствора натрия едкого и 0,5 мл реактива А.

Пробы колориметрируют сразу после внесения реактивов на фотоэлектроколориметре (ФЭК) при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 5 мм против контрольного раствора. По показаниям прибора строят кривую зависимости оптической плотности от концентрации пептона. Калибровочную кривую проверяют перед каждым определением.

Подготовка проб. Для анализа используют гидролизаты и питательные среды, разведенные в 10 раз 0,9%-м раствором натрия хлорида.

Ход определения

К 5 мл испытуемого раствора добавляют 0,5 мл 10%-го раствора едкого натрия и 0,5 мл реактива А.

Одновременно готовят контрольную пробу и проводят определение, как описано при построении калибровочной кривой. Концентрацию пептона в испытуемом растворе в процентах вычисляют по калибровочной кривой и производят перерасчет с учетом разведения.*

* Методика может быть рекомендована для гидролизатов и питательных сред с определенной цветностью. Показатель оптической плотности среды не должен превышать 0,2 при определении на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 5 мм против воды.

6.8. Определение общего азота с реактивом Несслера

Принцип метода основан на свойстве реактива Несслера давать цветную реакцию с ионами аммония (NH), образующимися после минерализации азотсодержащих органических веществ.

Построение калибровочной кривой. В пробирки вносят по 0,1-0,2-0,3-0,4-0,5 мл раствора аммония серно-кислого (содержание азота от 5 до 25 мкг с интервалом 5 мкг). Объем каждой пробы доводят водой до 9,5 мл, перемешивают, затем прибавляют по 0,5 мл реактива Несслера. Пробы вновь перемешивают, а затем колориметрируют на фотоэлектроколориметре с синим светофильтром (

400 нм) в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Раствором сравнения служит контрольная проба, содержащая 0,5 мл реактива Несслера в 9,5 мл воды. По показаниям прибора строят кривую зависимости оптической плотности от концентрации азота. Калибровочный график воспроизводят при каждом определении.

Ход определения

Подготовка проб. Для анализа в пробирку пипеткой вносят 1 мл раствора образца, с содержанием общего азота 100-200 мкг*.

Жидкий гидролизат следует развести в 100 раз.

На песчаной бане минерализуют 1 мл исследуемого образца (2 параллельные пробы) с 0,1 мл концентрированной серной кислоты в пробирках со стеклянными колпачками. Параллельно минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Для ускорения минерализации в охлажденные испытуемые и контрольные пробы периодически добавляют по 1-2 капли пергидроля. Сжигание продолжают до обесцвечивания содержимого пробирок (не менее 10 ч).

400 нм) в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Раствором сравнения служит раствор, приготовленный аналогично образцу.

Содержание общего азота в препарате в процентах () вычисляют по формуле:

Для сухого образца (сухой гидролизат, сухая питательная среда)

,

— коэффициент пересчета в проценты;

— количество анализируемого препарата (мл);

— анализируемая навеска образца (мг), содержащаяся в 1 мл раствора образца;

— коэффициент пересчета микрограммов в миллиграммы.

Для жидкого образца (жидкий гидролизат):

,

— степень разведения жидкого гидролизата;

— количество препарата (мл), взятое для колориметрирования;

— количество исследуемого образца (мл), взятое для минерализации;

Источник

Мук по питательным средам

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методы контроля бактериологических питательных сред

Дата введения: с момента утверждения

1. Разработаны: Федеральным государственным учреждением науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (С.М.Суханова, Н.Е.Захарова, Э.И.Конду, И.А.Голубенко).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3).

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 18 января 2008 г.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания предназначены для работников организаций, осуществляющих:

изготовление и контроль качества бактериологических питательных сред (диагностических, для культивирования, транспортных и др.) и (или) их основ при серийном промышленном выпуске;

конструирование новых питательных сред;

изготовление сред из отдельных компонентов по прописям, а также могут быть использованы:

— при экспертизе НД и

— при проведении внутрилабораторного контроля качества коммерческих питательных сред.

1.2. Настоящие методические указания распространяются на исследования бактериологических питательных сред отечественного и зарубежного производства.

2. Нормативные и методические ссылки

2.1. Государственная Фармакопея СССР XI издания. Вып.1, 2.

2.4. Санитарные правила СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности» /Госкомсанэпиднадзор России. М., 1996.

2.5. Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований: ГОСТ Р 51446-99 (ISO 7218-96).

2.6. Агар микробиологический: ГОСТ 17206-96.

2.7. Методические рекомендации «Определение сроков годности сухих микробиологических сред и питательных основ методом «Ускоренного старения» при повышенной температуре». Махачкала, 1987.

2.8. Водоросли морские, травы морские и продукты их переработки: ГОСТ 26185-84.

2.9. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. М., 1980.

2.10. Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред. М., 1977.

2.11. Методические указания «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»: МУК 4.2.1890-04.

3. Общие положения

3.1. Целью введения настоящих методических указаний является регламентация стандартных методов контроля бактериологических питательных сред.

3.2. Методические указания содержат описание общих методов контроля бактериологических питательных сред. Особенности контроля качества сред, не охватываемые настоящим документом, должны быть описаны в нормативной документации на эти препараты.

4. Термины и определения

4.5. Оценка результатов. Определение положительного или отрицательного результата.

5. Общие указания при оценке качества питательных сред

I. Оценка качества питательных сред и их компонентов проводится с помощью совокупности показателей, выбираемых для контроля среды в соответствии с ее назначением, и включает:*

1. Контроль качества препарата по физико-химическим показателям.

* Используемые в лабораториях коммерческие питательные среды контролируются на предприятиях-изготовителях, поэтому внутрилабораторный контроль их качества проводят только в случаях:

указания на необходимость проведения контроля в приказах Минздрава РФ, инструкции по применению или других документах;

несоответствия клинического диагноза результатам микробиологического исследования в лаборатории;

неудовлетворительного выполнения внешней оценки качества микробиологических исследований;

неудовлетворительного качества среды при использовании в практической работе;

несоответствия величины колоний искомого микроорганизма данному виду бактерий при росте в данной среде;

позднего появления роста культуры в среде, не соответствующего срокам для данного микроорганизма;

отсутствия подавления роста сопутствующей микрофлоры на среде с заявленными ингибирующими свойствами.

Для внутрилабораторного контроля качества коммерческих питательных сред, контроль которых не предусмотрен действующими нормативными документами, необходимо проводить визуальную оценку качества, определять значение рН готовой среды, стерильность каждой приготовленной серии (см. р.7.1.1 «Контроль чистоты розлива»), а также оценивать качество среды с помощью контрольных штаммов.

2. Контроль специфической активности препарата по биологическим показателям.

Перечень показателей, необходимых для контроля основных групп питательных сред, приведен в прилож.1.

Готовую среду засевают культурой (тест-штаммом) того (целевого) микроорганизма, для которого приготовлена среда, и гетерологичных штаммов и визуально (или под малым увеличением микроскопа) изучают характер его роста. Рост микроорганизмов оценивают с помощью количественных (для плотных сред), полуколичественных или качественных методов*.

Для оценки результатов качественным методом определяют наличие и характер роста каждого из тест-штаммов. Рост целевых тест-штаммов должен быть типичным по цвету, размеру и морфологии колоний; рост нецелевых должен частично или полностью подавляться.

Для оценки результатов количественным методом при интерпретации ингибирующих, накопительных или задерживающих рост свойств среды, подсчитывают количество выросших колоний на тестируемой и контрольной (среде выращивания) средах.

Требования к специфической активности зарегистрированных в РФ бактериологических питательных сред и добавок перечислены в прилож.2.

III. Серия среды признается годной только после проведения всех видов контроля.

6. Определение физико-химических показателей

6.1. Общие указания для приготовления реактивов

Концентрация. При указании концентрации растворов в процентах, следует подразумевать весобъемные проценты. Например, для приготовления 10%-го раствора следует брать 10 г вещества на 100 мл готового раствора.

Точная навеска. Взвешивание на аналитических весах с точностью до 0,0002 г. Если не указано «точная навеска», то навеску берут с точностью до 0,01 г.

Оценка результатов. Результаты рассчитывают на основании не менее двух параллельных определений. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое значений результатов двух параллельных измерений. Допустимое отклонение от средней величины не должно превышать 10%.

Реактивы и титрованные растворы. Реактивы и титрованные растворы, приведенные в настоящих МУК, описаны в соответствующих разделах Государственной Фармакопеи СССР XI издания, вып.2, если нет других указаний.

Квалификация реактивов. Для анализа необходимо использовать реактивы квалификации хч и чда.

Хранение реактивов. Растворы реактивов хранят при температуре 18-20 °С в течение 6 мес., если нет изменений их физических свойств или нет других указаний.

Контрольный опыт (контроль на реактивы). Под контрольным опытом подразумевают определение, проводимое с тем же количеством реактивов и в тех же условиях, но без испытуемого препарата, вместо которого используют растворитель.

6.2. Описание препарата

Внешний вид препарата определяют визуально, указывая:

физическое состояние (жидкость, мелкодисперсный порошок, гель);

прозрачность (для препаратов готовых к применению). Препарат может быть либо прозрачным, либо с незначительной опалесценцией, либо мутный);

гигроскопичность (для сухих препаратов);

светочувствительность (при наличии в составе компонентов, разрушающихся на свету.

* При описании цвета оттенок указывают перед основным цветом (например, «желтовато-коричневый»).

6.3. Определение растворимости

Количество препарата (г), необходимое для приготовления конкретной серии питательной среды, должно растворяться при перемешивании и, если необходимо, при кипячении в течение 2-3 мин.

Препарат считают растворившимся, если в растворе при визуальном наблюдении в проходящем свете не обнаруживаются частицы вещества.

Для препаратов, образующих при растворении мутные растворы, соответствующее указание должно быть приведено в нормативной документации и инструкции по применению.

Источник