мук лабораторная диагностика холеры

Мук лабораторная диагностика холеры

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Лабораторная диагностика холеры

Дата введения 2002-04-01

1. РАЗРАБОТАНЫ сотрудниками Министерства здравоохранения Российской Федерации Ю.М.Федоровым, Н.Я.Жилиной; Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института Ю.М.Ломовым, Б.Н.Мишанькиным, Л.С.Подосинниковой, Л.Г.Воронежской, И.Я Черепахиной, Т.А.Кудряковой, Б.Л.Мазрухо, Л.М.Смоликовой, И.В.Рыжко, Р.И.Цураевой, Э.А.Москвитиной, Б.П.Голубевым; Противочумного Центра Минздрава России А.А.Кюрегяном, С.М.Ивановой, Ю.С.Королевым; Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» А.К.Адамовым, З.В.Малыхиной, Т.В.Бугорковой, Н.И.Смирновой, Л.Ф.Ливановой; Иркутского научно-исследовательского противочумного института А.С.Марамовичем, В.С.Ганиным, Л.Я.Урбанович, В.И.Погореловым; Ставропольского научно-исследовательского противочумного института В.Н.Савельевым; Причерноморской противочумной станции Г.В.Гальцевой; Государственного Центра по антибиотикам С.В.Сидоренко; Российской медицинской академии последипломного образования Е.А.Ведьминой; ГИСК им.Л.А.Тарасевича Минздрава России Т.И.Анисимовой, Л.В.Саяпиной.

3. ВВЕДЕНЫ ВЗАМЕН «Инструкции по организации и проведению противохолерных мероприятий» утв. МЗ и МП РФ от 09.06.95 N 01-19/50-11.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания разработаны для внедрения и применения санитарно-эпидемиологических правил СП 3.1.1086-02 «Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору» в части, касающейся организации и проведения лабораторной диагностики холеры.

1.2. Настоящие методические указания предназначены для специалистов бактериологических лабораторий центров госсанэпиднадзора, лечебно-профилактических и противочумных учреждений.

2. Нормативные ссылки

2.1. Санитарные правила по безопасности работ с микроорганизмами СП 1.2.006-93*. Ч.I: Порядок выдачи разрешения на работу с микроорганизмами I-IV групп патогенности и рекомбинантными молекулами ДНК.

2.2. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности: СП 1.2.011-94*.

2.3. Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности: СП 1.2.036-95.

2.4. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами: СП 1.2.731-99.

2.5 Условия транспортирования и хранения медицинских иммунобиологических препаратов: СП 3.3.2.028-95.

2.7. Профилактика холеры. Организационные мероприятия. Оценка противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий на случай возникновения очага холеры: МУ 3.1.1096-02.

3. Характеристика возбудителя холеры

Наличие гена холерного токсина (ctx AB), независимо от его экспрессии, отличает токсигенные (эпидемические) от свободноживущих холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп; кроме того, в геноме токсигенных эпидемически значимых вариантов присутствует ряд генов, кодирующих синтез белка ТОХ Т, передающего сигналы запуска синтеза холерного токсина (СТ), токсинкорегулируемых пилей адгезии (TCP) и фактора колонизации (ACF). Известно, что свободноживущие атоксигенные холерные вибрионы О1 чрезвычайно редко имеют tcp ген в своей хромосоме.

Характеристика генома выделенных штаммов молекулярно-биологическими методами может быть использована для эпидемиологического анализа и решения вопросов заноса, распространения и укоренения инфекции.

Известно многообразие фенотипических изменений атоксигенных холерных вибрионов, выделенных на свободных от холеры территориях, а также распространение эпидемически значимых фагорезистентных вариантов холерных вибрионов и штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.

4. Организация лабораторных исследований

Диагностические исследования на холеру в регламентированном объеме могут проводить:

— бактериологические лаборатории территориальных центров госсанэпиднадзора, лечебно-профилактических учреждений и ведомственных служб, имеющие разрешение на работу с микроорганизмами III группы патогенности;

— лаборатории особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора в субъектах федерации (республиканских, краевых, областных, городских), ведомственных учреждений, имеющие разрешение на проведение диагностических исследований на холеру;

— лаборатории противочумных учреждений, имеющие разрешение на проведение диагностических исследований на холеру и на работу с возбудителем холеры.

Организация и выполнение диагностических исследований на холеру в лабораториях должны осуществляться в соответствии с требованиями, регламентирующими:

— порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности.

Порядок получения лабораториями разрешения на работу с микроорганизмами I-IV групп патогенности определяется действующими нормативными документами о порядке выдачи разрешений на эти виды работ.

Все диагностические лаборатории, выполняющие работы с микроорганизмами I-IV групп патогенности, должны иметь лицензию на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний.

В условиях осложнения эпидемиологической обстановки временное разрешение на проведение диагностических исследований на холеру бактериологическим лабораториям центров госсанэпиднадзора, включенным в состав лабораторной службы очага, в случае расширения их функциональных обязанностей, предоставляется решением медицинского штаба очага.

4.1. При осуществлении эпидемиологического надзора

4.1.1. Бактериологические лаборатории центров госсанэпиднадзора в городах и районах, учреждений лечебно-профилактических и ведомственных служб:

— проводят плановые диагностические исследования на холеру материала от больных острыми кишечными инфекциями, определенного контингента здоровых лиц и проб из объектов окружающей среды в объеме, предусмотренном для соответствующего типа территорий по эпидпроявлениям холеры. Исследования ведут до установления отрицательного результата анализа или до выделения культуры с характерным для вибрионов ростом на агаровой и полиуглеводной средах и положительной реакцией на оксидазу. Культуры проверяют на чистоту в мазке, окрашенном по Граму, на подвижность и в реакции агглютинации на стекле (далее слайд-агглютинации) с холерными сыворотками О1, Огава, Инаба, РО и О139.

При положительном результате слайд-агглютинации немедленно сообщают в территориальный центр госсанэпиднадзора, культуру для окончательной идентификации немедленно доставляют в специализированную лабораторию в установленном порядке.

При отрицательном результате слайд-агглютинации:

— культуру, выделенную от людей, направляют для дальнейшей идентификации в специализированную лабораторию;

— неагглютинирующиеся культуры, выделенные из объектов окружающей среды, идентифицируют на месте или по согласованию передают в территориальный центр госсанэпиднадзора.

4.1.2. Лаборатории особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора в республиках, краях, областях, городах и ведомственных учреждений:

— выполняют диагностическое исследование материала от больных и умерших с подозрением на холеру и проб из объектов окружающей среды;

— идентифицируют культуры вибрионов, выделенных в территориальных и ведомственных лабораториях, определяя их таксономическую принадлежность, а также определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп по регламентированным для лабораторий тестам;

— осуществляют (или организуют) бактериологический контроль качества питательных сред и других диагностических препаратов, используемых в территориальных лабораториях;

— представляют оперативную информацию о выделении культур холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп;

— в установленном порядке немедленно передают в территориальное противочумное учреждение культуры холерных вибрионов, таксономическая принадлежность или токсигенность которых имеющимися средствами диагностики не определяется;

— в течение 5 дней после окончания идентификации передают в территориальное противочумное учреждение или головной по проблеме «Холера» противочумный институт все культуры холерных вибрионов О1, О139, независимо от объекта обследования, и других серогрупп при выделении от больных;

— контролируют деятельность территориальных лабораторий, оказывают им методическую помощь по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой.

4.1.3. Лаборатории противочумных учреждений:

— проводят исследования материала от больных и умерших с подозрением на заболевание холерой, а также проб из объектов окружающей среды;

— подтверждают таксономическую принадлежность культур холерных вибрионов, выделенных на курируемой территории;

— идентифицируют все атипичные культуры холерных вибрионов с использованием дополнительных методов серологической, биохимической и других видов идентификации с целью уточнения таксономической принадлежности;

— определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность культур;

— осуществляют методическое руководство по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой на курируемой территории;

4.2. При проведении противоэпидемических мероприятий

Организация и регламентирование деятельности лабораторий, а также формирование лабораторной службы в очаге холеры осуществляется в соответствии с действующими методическими указаниями по вопросам профилактики холеры, организации мероприятий и оценки противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий на случай возникновения очага холеры.

5. Бактериологическое исследование

В системе противохолерных мероприятий значительное место занимает бактериологический анализ, от правильности и своевременности проведения которого зависит характер и объем профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Исследования проводят с целью:

— выявления больных холерой и вибриононосителей;

— установления окончательного диагноза при вскрытии трупов лиц, умерших от подозрительного на холеру заболевания;

— обоснования выбора средств этиотропной терапии холеры;

— бактериологического контроля эффективности лечения больных холерой и вибриононосителей;

— бактериологического контроля объектов окружающей среды, в т.ч. поверхностных водоемов;

— бактериологического контроля эффективности обеззараживания в очаге инфекции.

5.1. Отбор и доставка материала на исследование

Материалом для бактериологического анализа могут служить испражнения, рвотные массы, желчь, трупный материал (отрезки тонкого кишечника и желчный пузырь); предметы, загрязненные испражнениями (постельное и нательное белье и др.); вода, ил, гидробионты, сточные воды, содержимое выгребных туалетов; смывы с объектов окружающей среды, пищевые продукты, мухи и др.

Материал от больного забирает медицинский персонал лечебного учреждения немедленно после выявления больного и до начала лечения антибиотиками. Руководитель несет ответственность за правильность отбора, хранения и доставки проб в лабораторию.

Источник

Мук лабораторная диагностика холеры

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней

Дата введения 2011-06-01

1. РАЗРАБОТАНЫ Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (Ю.М.Ломов, Э.А.Москвитина, Н.Р.Телесманич, В.Д.Кругликов, И.Я.Черепахина, В.В.Балахнова, И.В.Архангельская); Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора (В.В.Кутырев, Е.С.Казакова, И.Н.Шарова, Н.А.Осина, С.А.Щербакова, Н.И.Смирнова); Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (С.В.Балахонов, Л.Я.Урбанович, Л.В.Миронова, Е.С.Куликалова, А.С.Кожевникова); Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (В.Н.Савельев); Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Противочумный центр» Роспотребнадзора (В.Е.Безсмертный, С.М.Иванова); Федеральным бюджетным учреждением здравоохранения «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (В.Г.Сенникова, М.В.Зароченцев, В.В.Мордвинова); Федеральным государственным учреждением науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора (И.А.Дятлов, С.Ф.Бикетов, Е.И.Баранова, М.В.Храмов, Е.А.Тюрин); Федеральным государственным бюджетным учреждением «ГИСК им. Л.А.Тарасевича» Минздравсоцразвития (И.В.Борисевич, Л.В.Саяпина).

2. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 25 мая 2011 г. и введены в действие с 1 июня 2011 г.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания определяют порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней, формы и методы их взаимодействия, номенклатуру и объем исследования, требования к лабораториям, специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований, материально-техническому обеспечению исследований, биологической безопасности проведения работ.

1.2. Настоящие методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор в Российской Федерации, специалистов противочумных учреждений, органов управления здравоохранением и лечебно-профилактических учреждений.

2. Нормативные ссылки

2.6. Санитарные правила «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности»: СП 1.2.036-95 (Утв. постановлением Госкомсанэпиднадзора РФ от 28.08.1995 N 14).

2.7. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами». СанПиН 2.1.7.2790-10 (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 9.12.2010 N 163. Зарегистрировано в Минюсте РФ 17.02.2011 N 19871).

2.8. Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». СП 1.3.1285-03 (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 15.04.2003 N 42 «О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.1285-03». Зарегистрировано в Минюсте РФ 10.05.2003 N 4545).

2.9. Санитарно-эпидемиологические правила «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами». СП 1.3.1318-03 (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.04.2003 N 85 «О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.2.1318-03». Зарегистрировано в Минюсте РФ 19.05.2003 N 4558).

2.10. Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». СП 1.3.2322-08 (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2008 N 4 «Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08». Зарегистрировано в Минюсте РФ 21.02.2008 N 11197).

2.11. Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» Дополнения и изменения N 1 к СП 1.3.2322-08″: СП 1.3.2518-09 (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 2.06.2009 N 42. Зарегистрировано в Минюсте РФ 8.07.2009 N 14280).

2.13. Санитарно-эпидемиологические правила «Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору за холерой на территории Российской Федерации»: СП 3.1.1.2521-09 (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 9.06.2009 N 43 «Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 3.1.1.2521-09». Зарегистрировано в Минюсте РФ 9.07.2009 N 14285).

2.14. Методические указания «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» МУ 1.3.2569-09.

2.15. Методические указания «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии»: МУ 3.3.2.2124-06.

2.16. Методические указания «Лабораторная диагностика холеры»: МУК 4.2.2218-07.

2.17. Методические указания «Профилактика холеры. Организационные мероприятия. Оценка противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий на случай возникновения очага холеры»: МУ 3.1.1.2232-07.

2.18. Методические указания. «Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чумы, сибирской язвы, холеры, туляремии, бруцеллеза, сапа и мелиоидоза) к антибактериальным препаратам»: МУК 4.2.2495-09.

2.19. Методические указания «Методы контроля бактериологических питательных сред»: МУК 4.2.2316-08.

2.20. Методические указания «Серологические методы в диагностике холеры»: МУК 4.2.2315-08. Дополнения к МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры».

3. Перечень сокращений

4. Общие положения

Характеристика болезни и возбудителя холеры

К виду Vibrio cholerae отнесены грамотрицательные, аспорогенные, полиморфные, слегка изогнутые или прямые палочки длиной 1,5-3,0 мкм и шириной 0,2-0,6 мкм, с одним полярно расположенным жгутиком, который длиннее тела клетки в 2-3 раза.

Холерные вибрионы быстро размножаются в 1%-й пептонной воде, образуя через 6-8 ч на поверхности среды нежную пленку. Через 24 ч роста пленка становится грубой, среда слабо мутнеет. На поверхности плотного питательного агара (щелочной агар, рН 8,0) через 18-24 ч инкубации рост холерных вибрионов проявляется в формировании крупных (2-3 мм), гладких, прозрачных колоний с ровным краем, которые легко эмульгируются в физиологическом растворе. В косо проходящем свете они отсвечивают голубоватым цветом. На элективной среде TCBS на зеленом фоне среды колонии вибрионов круглые, гладкие с ровным краем, плоские, желтого цвета. При более длительной инкубации желтый цвет колоний часто переходит в зеленый.

Помимо этого, холерные вибрионы расщепляют до кислоты без газа сахарозу, маннозу, крахмал, маннит, не расщепляют арабинозу, салицин, дульцит, инозит. В отдельных случаях ферментацию маннозы холерными вибрионами возможно определить только в анаэробных условиях. Холерные вибрионы восстанавливают нитраты в нитриты, образуют индол, разжижают желатину, продуцируют нейраминидазу, лецитиназу, триглицероллипазу.

V. cholerae по наличию специфического О-антигена распределяются на серологические группы. В настоящее время известно 206 серологических О групп холерных вибрионов. Возбудителями холеры являются холерные вибрионы О1 и О139 серологических групп. Холерные вибрионы других не О1/не О139 серологических групп могут вызывать спорадические или групповые случаи диарей, не склонные к эпидемическому распространению.

У холерных вибрионов имеется общий жгутиковый Н-антиген.

Холерные вибрионы являются носителями умеренных фагов с низкой литической активностью. Известны фаги, активные в отношении холерных вибрионов О1 и не О1, включая О139 серологическую группу, а также с более узким спектром литического действия, в пределах отдельных групп штаммов, например ctx и ctx холерных вибрионов.

Нетоксигенные штаммы холерных вибрионов обладают гемолитической активностью, которая включает активность нескольких компонентов: рициноподобного галактозоспецифичного лектина (hlyA) и комплекса ферментов гидролаз, ведущим из которых является липаза (lipА). Гемолитическая активность является ведущим фактором патогенности у штаммов возбудителей холеры О1 и О139 серогрупп, не имеющих ген холерного токсина. Такие штаммы могут вызывать спорадические случаи диареи различной степени тяжести, но не склонны к широкому распространению. Способность к гемолизу эритроцитов барана в тесте Грейга, коррелирующая с липазной активностью, является визуализированным тестом, свидетельствующим о том, что штамм не может вызывать тяжёлую клиническую картину холеры и не способен к широкому эпидемическому распространению.

Понятие эпидемической значимости базируется на определении комплекса показателей:

Холерные вибрионы имеют две хромосомы: первую (или большую размером 2960 т.п.н.) и вторую (или малую размером 1070 т.п.н.). На большой хромосоме V. cholerae расположены гены патогенности: ctxAB, кодирующий биосинтез СТ, гены, определяющие продукцию дополнительных холерных токсинов, гены tcpA-F, кодирующие продукцию TCP, а также гены, необходимые для репликации, транскрипции, репарации ДНК, биосинтеза клеточной стенки и О-антигена. Биосинтез О1 антигена определяет кластер генов, обозначенный как wbe. Продукция О139 антигена кодируется кластером генов, также локализованном на большой хромосоме и имеющим обозначение wbf. Выявление с помощью ПЦР генов wbe и wbf, специфичных для холерных вибрионов О1 и О139 серологических групп, позволяет определить серогруппу возбудителя холеры. На малой хромосоме, помимо генов с неустановленной функцией, локализованы структурные гены hlyA, отвечающие за синтез термолабильного гемолизина, а также остров интегронов, содержащий гены, кодирующие антибиотикоустойчивость, и участвующий в приобретении новых генов. Следует отметить, что ген hlyA присутствует в хромосоме всех штаммов V. cholerae, как способных к биосинтезу термолабильного гемолизина, так и не продуцирующих этот белок. Однако в гене hlyA холерных вибрионов классического биовара, в отличие от такового V. cholerae эльтор, имеется делеция протяженностью 11 п.н., вследствие чего продукция гемолизина вибрионами этого биовара невозможна.

Штаммы холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, содержащие гены ctxAB и tcpA-F, вызывают холеру и являются эпидзначимыми. Эти штаммы не лизируют эритроциты барана в пробе Грейга. Эпидемически не значимые штаммы холерных вибрионов, не содержащие генов ctxAB и tcpA-F, лизируют эритроциты барана в пробе Грейга. Нетоксигенные (не содержащие гена холерного токсина) ctxAB варианты холерных вибрионов О1, также как и других серогрупп, могут вызывать спорадические (единичные) или групповые (при общем источнике инфицирования) заболевания, не склонные к эпидемическому распространению.

Источник

МУК 4.2.2218-07 Лабораторная диагностика холеры

Лабораторная диагностика холеры

Руководитель Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека,

Главный государственный санитарный врач

Дата введения: 1 августа 2007 г.

Лабораторная диагностика холеры

Методические указания
МУК 4.2.2218-07

1. Область применения

2. Нормативные ссылки

3. Характеристика возбудителя холеры

Возбудителями холеры являются холерные вибрионы О1 (классического и эльтор биоваров) и О 139 серогрупп.

Характеристика генома выделенных холерных вибрионов биологическими методами широко используется для эпидемиологического анализа и оценки эпидемической значимости выделенных штаммов.

4. Организация лабораторных исследований

Диагностические исследования на холеру в регламентированном объеме могут проводить:

· бактериологические лаборатории учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, лечебно-профилактических и противочумных учреждений, имеющие разрешение на работу с микроорганизмами III группы патогенности;

· лаборатории особо опасных инфекций центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора и ведомств, имеющие разрешение на проведение диагностических исследований на холеру;

· лаборатории противочумных учреждений, имеющие разрешение на проведение диагностических исследований на холеру и на работу с возбудителем холеры.

Организация и выполнение диагностических исследований на холеру в лабораториях должны осуществляться в соответствии с требованиями, регламентирующими:

· порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов IV группы патогенности.

Порядок получения лабораториями разрешения на диагностические исследования на холеру определяется действующими нормативными документами о порядке выдачи разрешений на эти виды работ.

В условиях осложнения эпидемиологической обстановки временное разрешение на проведение диагностических исследований на холеру бактериологическим лабораториям учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, и другим, функционирующим в составе лабораторной службы очага, в случае расширения их функциональных обязанностей представляется решением медицинского штаба очага.

4.1. При осуществлении эпидемиологического надзора

Исследования ведут до установления отрицательного результата анализа или до выделения культуры с характерным для вибрионов ростом на агаровой и полиуглеводной средах и положительной реакцией на оксидазу. Культуры проверяют на чистоту в мазке, окрашенном по Граму, на подвижность и в реакции агглютинации на стекле (далее слайд-агглютинации) с холерными сыворотками О1, Огава, Инаба, РО и О139.

При положительном результате слайд-агглютинации немедленно сообщают в органы Роспотребнадзора в субъекте Российской Федерации, культуру для окончательной идентификации немедленно доставляют в специализированную лабораторию в установленном порядке.

При отрицательном результате слайд-агглютинации:

· неагглютинирующиеся холерными сыворотками О1 и О139 культуры, выделенные от людей, направляют для дальнейшей идентификации в специализированную лабораторию;

· неагглютинирующиеся холерными сыворотками О1 и О139 культуры, выделенные из объектов окружающей среды, идентифицируют на месте или по согласованию передают в учреждение Роспотребнадзора.

· выполняют диагностическое исследование материала от больных и умерших с подозрением на холеру и проб из объектов окружающей среды;

· идентифицируют культуры вибрионов, выделенных в территориальных и ведомственных лабораториях, определяя их таксономическую принадлежность, а также определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп по регламентированным для этих лабораторий тестам;

· осуществляют (или организуют) бактериологический контроль качества питательных сред и других диагностических препаратов, используемых в территориальных лабораториях;

· представляют оперативную информацию о выделении культур холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп;

· в установленном порядке немедленно передают в территориальное противочумное учреждение культуры холерных вибрионов, таксономическая принадлежность или токсигенность которых имеющимися средствами диагностики не определяется;

· в течение 5 дней после окончания идентификации передают в территориальное противочумное учреждение или в головной по проблеме «Холера» Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт все культуры холерных вибрионов О1, О139, независимо от объекта обследования, и других серогрупп при выделении от больных;

· контролируют деятельность территориальных лабораторий, оказывают им методическую помощь по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой.

· проводят исследования материала от больных и умерших с подозрением на заболевание холерой, а также проб из объектов окружающей среды;

· подтверждают таксономическую принадлежность культур холерных вибрионов, выделенных на курируемой территории;

· идентифицируют все атипичные культуры холерных вибрионов с использованием дополнительных методов серологической, биохимической и других видов идентификации с целью уточнения таксономической принадлежности;

· определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность культур;

· осуществляют методическое руководство по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой на курируемой территории;

· в установленном порядке выделенные культуры холерных вибрионов с паспортами передают в территориальный противочумный институт, головной по проблеме «Холера» Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт, одновременно паспорта на эти же культуры направляют в противочумный центр Роспотребнадзора.

4.2. При проведении противоэпидемических мероприятий

Организация и регламентирование деятельности лабораторий, а также формирование лабораторной службы в очаге холеры осуществляются в соответствии с действующими нормативными документами по организации и проведению противохолерных мероприятий.

5. Бактериологическое исследование

В системе противохолерных мероприятий значительное место занимает бактериологический анализ, от правильности и своевременности проведения которого зависит характер и объем профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Исследования проводят с целью:

· выявления больных холерой и вибриононосителей;

· установления окончательного диагноза при вскрытии трупов лиц, умерших от подозрительного на холеру заболевания;

· обоснования выбора средств этиотропной терапии холеры;

· бактериологического контроля эффективности лечения больных холерой и вибриононосителей;

· бактериологического контроля объектов окружающей среды, в том числе поверхностных водоемов;

· бактериологического контроля эффективности обеззараживания в очаге инфекции.

5.1. Отбор и доставка материала на исследование

Материалом для бактериологического анализа могут служить испражнения, рвотные массы, желчь, трупный материал (отрезки тонкого кишечника и желчный пузырь); предметы, загрязненные испражнениями (постельное и нательное белье и др.); вода, ил, гидробионты, сточные воды, содержимое выгребных туалетов; смывы с объектов окружающей среды, пищевые продукты, мухи и др.

Материал от больного забирает медицинский персонал лечебного учреждения, немедленно после выявления больного и до начала лечения антибиотиками. Руководитель является ответственным за правильность отбора, хранения и своевременность доставки проб в лабораторию.

Для отбора проб используют чистую стерильную посуду, не содержащую следов дезинфицирующих растворов. Стерилизацию посуды и других средств забора материала проводят автоклавированием, сухим жаром или кипячением в 2 %-м растворе пищевой соды.

Материал для исследования должен быть доставлен не позже, чем через 2 ч после его взятия. В случае удлинения сроков доставки используют транспортные среды. Наиболее удобной и достаточно эффективной является 1 %-я пептонная вода (рН 8,4 ± 0,1).

На флаконах (пробирках) с пептонной водой, передаваемых в стационары для отбора проб, должна быть этикетка или надпись с указанием названия среды и даты ее приготовления.

Среды во флаконах или пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками, рекомендуется хранить не более 2-х суток при температуре не выше (10,0 ± 0,2) °С при условии сохранения их стерильности. Целесообразно обеспечение стационаров и групп забора проб средами в закатанных флаконах.

При вынужденном удлинении сроков доставки материала в лабораторию (длительное плавание, круиз и т.п.) можно использовать полоски фильтровальной (промокательной) бумаги. Жидкими испражнениями пропитывают полоску обычной плотной промокательной бумаги или другого гигроскопичного материала и герметично упаковывают в пластиковый пакет для предохранения от высыхания при транспортировании в лабораторию. На таких полосках холерные вибрионы выживают до четырех-пяти или более недель, пока сохраняется влага.

При обследовании на вибриононосительство материал забирает медицинский персонал лечебно-профилактических учреждений, в очаге создают специальные группы по отбору проб, работающие под руководством эпидемиологов.

Для взятия материала у больных с обильным водянистым стулом можно использовать резиновый катетер, один конец которого вводят в прямую кишку, а другой опускают в банку. Жидкие испражнения стекают в сосуд свободно или при легком массаже брюшной стенки.

Желчь берут при дуоденальном зондировании в лечебном учреждении. В отдельные пробирки собирают две порции: из желчного пузыря и желчных протоков (В и С). Материал доставляют нативным.

От умерших с подозрением на холеру берут отрезки (длиной около 10 см) верхней, средней и нижней частей тонкой кишки, разрез производят между двойными лигатурами, предварительно наложенными на оба конца изымаемого участка кишечника. Желчный пузырь после перевязки протока извлекают целиком. Содержимое кишечника и желчь от трупа можно взять стерильным шприцем с толстой иглой в объеме до 10 мл и перенести в емкость с 1 %-й пептонной водой. Взятые образцы органов трупа укладывают раздельно в стерильные банки.

Банки, пробирки с материалом закрывают непромокаемыми пробками и пергаментной бумагой, тщательно обрабатывают снаружи салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором, избегая затекания его внутрь. Все пробы этикетируют, укладывают в специально подготовленную для транспортирования металлическую тару и перевозят на служебном транспорте с сопровождающим. Форма направления дана в прилож. 1.

Воду (питьевую, из поверхностных водоемов и др.) для исследования берут в количестве 1 л на одну пробу в двух объемах по 500 мл в стерильную посуду с непромокаемой пробкой.

Из водопроводных кранов пробы воды берут после предварительного обжигания их спиртовым факелом и спуска воды в течение 10 мин при полном открытии крана.

Гидробионтов (рыб, лягушек и др.) отлавливают из водоемов любым способом и в закрытых банках, ведрах и других сосудах доставляют в лабораторию.

Ил и фитопланктон (водоросли) также помещают в стерильные банки и транспортируют в лабораторию.

Смывы с различных объектов окружающей среды берут ватным или марлевым тампоном, смоченным 0,9 %-м раствором натрия хлорида, с поверхности площадью 10×10 см. Тампон опускают во флакон или пробирку с 1 %-й пептонной водой.

Для сбора мух расставляют мухоловки, в которые наливают 1 %-ю пептонную воду с 1 % сахара.

Остатки пищи в очаге и по показаниям пищевые продукты отбирают по 200 г плотных и 0,5 л жидких, помещают в стеклянную посуду и закрывают. При необходимости в жидкие продукты добавляют основной пептон до 1 %-й концентрации.

Пробы объектов окружающей среды этикетируют, заполняют направление (прилож. 2) и отправляют в лабораторию с нарочным согласно действующим СП.

Перечень предметов, входящих в укладки для отбора проб, см. в прилож. 3, 4.

5.2. Порядок исследования

При бактериологическом исследовании на холеру используют различные питательные среды: жидкие среды обогащения, щелочной агар, элективные дифференциально-диагностические среды и набор сред для идентификации.

Применяют сухие среды производственного выпуска, имеющие номера госрегистрации и лицензии, или среды, консерванты, приготовленные по рецептуре и технологии, изложенной в разделе 7. Используемые для диагностики холеры питательные среды подлежат бактериологическому контролю в установленном порядке.

Агаровые среды перед использованием должны быть тщательно подсушены. Посев делают так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Все посевы инкубируют при температуре (37,0 ± 0,5) °С.

При исследовании материала от больных с подозрением на заболевание холерой не допускается использование в качестве накопительной среды 1 %-й пептонной воды с теллуритом калия.

В случае поступления материала от больных с подозрением на холеру могут быть использованы ускоренные методы исследования: иммунолюминесцентный, иммобилизация и ПЦР со специфическими праймерами (см. раздел 6) на первом, втором и последующих этапах исследования.

Материал, доставленный в 5 мл 1 %-й пептонной воды, полностью используют для посева в 50 мл среды накопления. В случае поступления в лабораторию материала, забранного в 50 мл 1 %-й пептонной воды во флаконе, и доставки его не позже 2-х ч после забора пробы, флакон помещают в термостат на 6 ч для накопления возбудителя. При доставке материала в более поздние сроки 5 мл его засевают в 50 мл 1 %-й пептонной воды.

При отрицательных результатах исследования нативного материала ускоренными методами их повторяют после 6 ч инкубации первой среды накопления.

Высев со второй среды накопления на щелочной агар.

Отбор подозрительных на холерный вибрион колоний в посевах на плотные среды нативного материала, а также в высевах из 1-й и 2-й накопительных сред.

а) Чашки с посевами просматривают в проходящем свете невооруженным глазом или с помощью лупы, а также (особенно в вечернее и ночное время) под стереоскопическим микроскопом в косо проходящем свете и отбирают подозрительные на вибрионы колонии для выделения и идентификации культуры.

В отдельных случаях в посевах могут также встречаться атипичные колонии: мутные с плотным центром, пигментированные (коричневые или светло-желтые), мельчайшие коккоподобные, шероховатые. Следует иметь в виду, что состав и качество питательных сред оказывают влияние на величину и плотность колоний холерных вибрионов, а также на морфологию клеток.

г) Подозрительные на вибрионы колонии, агглютинирующиеся и не агглютинирующиеся холерными О1 и О139 сыворотками, отсевают на одну из полиуглеводных сред (лактозо-сахарозная, Ресселя, Клиглера, маннозо-сахарозная или др.) и (или) на сектор пластинки щелочного агара для выделения чистой культуры, ее идентификации и определения чувствительности к антибиотикам.

На полиуглеводных средах отбирают культуры с типичными для вибрионов характером роста и изменениями:

· на двууглеводных средах (лактозо-сахарозная, глюкозо-лактозная и Клиглер) наблюдается характерное для кислой реакции изменение цвета столбика при сохранении цвета скошенной части без образования газа, а также сероводорода, продуцируемого в среде Клиглера, отдельными штаммами за счет расщепления серосодержащихся компонентов;

· в маннозо-сахарозной среде за счет ферментации обоих углеводов окрашиваются и столбик, и скошенная часть, а также в отдельных случаях улавливается образование сероводорода.

Культуры, выросшие на щелочном агаре, проверяют на наличие индофенолоксидазы.

Определяют морфологию микроорганизмов и чистоту отобранных культур, выросших на щелочном агаре и полиуглеводных средах, с помощью окрашенных по Граму мазков.

На основании положительных результатов агглютинации с сыворотками О1, Инаба или/ и Огава выдают предварительный положительный ответ о выделении из исследуемого материала культуры холерного вибриона О1 соответствующего серовара.

Если выделенная культура реагирует с холерной сывороткой О139 при отрицательных результатах с сыворотками О1 серогруппы, выдают ответ о выделении холерного вибриона О139 серогруппы.

Учитывают результаты идентификации и выдают окончательный ответ о выделении культуры холерного вибриона соответствующей серогруппы и биовара.

При выделении от больного или вибриононосителя культуры холерного вибриона, не агглютинирующейся холерными сыворотками О1 и О139, выдают ответ о выделении холерных вибрионов не О1 и не О139. При наличии вибрионных агглютинирующих диагностических сывороток определяют принадлежность к другим серогруппам (02-083).

Идентификацию культур, агглютинирующихся РО-сывороткой, см. в разделе 5.3.

а) Вода поверхностных водоемов и водопроводная

В зависимости от времени доставки пробы возможны следующие варианты посевов с целью первичного накопления вибрионов:

· воду фильтруют через мембранные фильтры № 2 или 3, смыв с которых сеют в накопительную среду и на агаровые пластинки. Из смыва с фильтра можно делать мазки для окраски флюоресцирующими холерными иммуноглобулинами, а также ставить РНГА, ПЦР со специфическими праймерами.

При интенсивном бактериальном загрязнении проб можно использовать III среду накопления.

б) Хозяйственно—бытовые сточные воды

Сточные воды, доставленные в объеме 1 л, фильтруют через бумажный или матерчатый фильтр для освобождения от механических примесей (при необходимости).

При заборе сточных вод марлевыми тампонами последние помещают в широкогорлые колбы или банки с накопительной средой (500 мл) и далее исследуют, как указано выше.

Дафний, циклопов и других рачков, так же, как и фитопланктон, растирают в ступке и засевают петлей в 1 %-ю пептонную воду.

Безалкогольные напитки исследуют тем же методом, что и воду.

После посева продукта устанавливают рН среды 8,4 ± 0,1.

д) Смывы с объектов внешней среды и мух засевают в 1 %-ю пептонную воду и исследуют по обычной схеме.

При осуществлении эпиднадзора за холерой исследование материала от обследуемых контингентов может выполняться в следующих вариантах.

В случаях, когда температура в помещении превышает 25 °С, материал следует брать в 1 %-ю пептонную воду с теллуритом калия.

Порядок исследования материала в зависимости от времени отбора и доставки его в лабораторию в 1 % ПВ

Время взятия материала

Время доставки в лабораторию

Среда для взятия проб

1-я среда накопления

2-я среда накопления. Высев с 1-й среды накопления

Высев со 2-й среды накопления

а) Среда накопления

б) Транспортная среда

а) Среда с доставленным материалом

б) посев в 50 мл 1 % ПВ

Через 6 ч инкубации пересев в 1 % ПВ с ТК и высев на щелочной агар и (или) ЭС

В начале следующего рабочего дня

После 10 00 в течение рабочего дня лаборатории

9 00 следующего дня пересев в 1 % ПВ, высев на щелочной агар и (или) ЭС

Через 6 ч инкубации

По окончании рабочего дня лаборатории

До 10 00 следующего дня

Через 6 ч инкубации пересев в 1 % ПВ с ТК, высев на щелочной агар и (или) ЭС

В начале следующего рабочего дня

Выходные дни лаборатории

Через 6 ч инкубации пересев в 1 % ПВ с ТК, высев на щелочной агар и (или) ЭС

В начале следующего рабочего дня

5.3. Идентификация культур холерных вибрионов

Культуры, выделенные на различных этапах, идентифицируют с целью определения их принадлежности к виду Vibrio cholerae соответствующей серогруппы (О1, О139 или других).

К виду V. cholerae относят грамотрицательные, аспорогенные, полиморфные палочки, слегка изогнутые или прямые, активно подвижные, с одним полярно расположенным жгутиком, образующие индофенолоксидазу, ферментирующие глюкозу в аэробных и анаэробных условиях до кислоты (без газа), расщепляющие маннит, маннозу, сахарозу, но не активные в отношении к арабинозе, инозиту, салицину и некоторым другим субстратам. Холерные вибрионы декарбоксилируют лизин и орнитин, но не обладают дигидролазой аргинина, образуют индол, обладают нитратредуктазой, не продуцируют сероводород. Таксономическое положение холерных вибрионов и признаки, дифференцирующие их от родственных микроорганизмов, приведены на рис. 2 и в табл. 2, 3, 4.

Основные дифференциальные признаки рода Vibrio и некоторых других микроорганизмов

Роды сем. Vibrionaceae

Окраска по Граму, морфология

Грамотрицательные полиморфные прямые или слегка изогнутые палочки

Рост на средах без NaCl

Чувствительность к 0-129 1)

О/Ф глюкозы в среде Хью-Лейфсона

Дифференциация патогенных для человека видов рода Vibrio

Рост в 1 %-й пептонной воде с NaCl:

Чувствительность к 0-129

Условные обозначения: см. обозначения табл. 2;

Отношение патогенных вибрионов к дифференцирующим углеводам

с образованием газа

с образованием газа у некоторых штаммов

Возбудителями холеры являются V. cholerae О1 (биоваров классического и эльтор; сероваров Инаба, Огава или Гикошима) и О139 серогрупп.

Токсигенные, эпидемически значимые варианты холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, содержащие гены холерного токсина (ctx АВ) и токсинкорегулируемых пилей (tcp А), вызывают заболевания холерой, склонные к эпидемическому распространению.

Нетоксигенные (не содержащие гена холерного токсина), эпидемически неопасные варианты холерных вибрионов О1 могут вызывать спорадические или групповые заболевания холерой при общем источнике заражения.

Вид V. cholerae помимо возбудителей холеры включает холерные вибрионы других О серогрупп, в настоящее время их известно более 200. Отдельные штаммы некоторых из них могут вызывать единичные случаи диарей или заболевания с внекишечной локализацией возбудителя. Известны отдельные групповые заболевания или вспышки диарей, обусловленных ими, при общем источнике заражения.

Идентификацию выделенных на полиуглеводной среде или щелочном агаре агглютинирующихся на стекле культур проводят по сокращенной или полной схеме.

Культуры оксидазопозитивных, активно подвижных вибрионов, расщепляющие глюкозу в среде Хью-Лейфсона до кислоты без газа, декорбоксилирующие лизин и орнитин, не обладающие дигидролазой аргинин, ферментирующие сахарозу, маннозу, маннит в средах Гисса и инактивные по отношению к арабинозе, агглютинирующиеся не менее чем до 1 /₂ титра сыворотками О1 и одной из вариантосп ецифических сывороток, относят к V. cholerae О1 серовара Огава или Инаба. Культуры, агглютинирующиеся обеими вариантоспецифическими сыворотками не менее чем до 1 /₂ титра, относят к серовару Гикошима. В случае агглютинабельности выделенной культуры обеими вариантоспецифическими сыворотками целесообразно повторить исследование с использованием различных серий коммерческих препаратов.

Для подтверждения принадлежности выделенной культуры холерных вибрионов к О139 серогруппе достаточно положительного результата в слайд-агглютинации с соответствующей сывороткой в рабочем разведении.

Полная схема идентификации культур, агглютинирующихся холерными сыворотками О1 серогруппы, предусматривает изучение их по дополнительным тестам, определяющим принадлежность к биовару (гемагглютинация, чувствительность к поликсимину, реакция Фогес-Проскауэра), определение антибиотикограммы, окончательную оценку эпидзначимости по результатам исследования в ПЦР на наличие генов ctx и tcp, и определение токсигенности на модели кроликов-сосунков.

Токсигенные штаммы холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, как правило, не лизируют эритроциты барана в пробе Грейга в отличие от нетоксигенных штаммов.

На культуры, имеющие характерные для вибрионов морфологические, культуральные и биохимические признаки, агглютинирующиеся О1 и одной из вариантоспецифических сывороток не менее чем до 1 /₂ титра, лизирующиеся и не лизирующиеся холерным и эльтор фагами, а также на культуры, агглютинирующиеся сывороткой О139, выдают окончательный ответ, указывая чувствительность их к антибиотикам и оценку эпидемической значимости по результатам ориентировочных или специальных исследований.

Признаки, дифференцирующие биовары V. cholerae О1

V. cholerae cholerae

Лизабельность холерными фагами:

Чувствительность к 50 ед/мл полимиксина В

Агглютинация куриных эритроцитов

На культуры, агглютинирующиеся одной из сывороток, выдают ответ о выделении V. cholerae О2, О5 или другой серогруппы.

Кроме этого, штаммы V. cholerae non О1 типируют бактериофагами диагностическими холерными ТЭПВ 1-7.

Энтеропатогенные холерные вибрионы не О1 группы относятся преимущественно к О2, О5, О6, О8, О11, О13, О18, О37, О47, О50, О62, О65, О82, О83 серогруппам и, как правило, лизируются фагами ТЭПВ 1, 4, 7.

У выделенных от больных штаммов холерных вибрионов не О1/О139 серогрупп определяют антибиотикограмму. Для выделенных из окружающей среды вибрионов, не агглютинирущихся холерными О1 и О139 сыворотками, целесообразность полной таксономической характеристики определяется в каждом случае отдельно для конкретных территорий и объектов с учетом эпидситуации по холере и регистрации острых кишечных заболеваний, обусловленных этими микроорганизмами.

Идентификация атипичных культур холерных вибрионов

В последние годы возросла частота встречаемости резистентных к диагностическим холерным фагам штаммов среди холерных вибрионов О1, выделяемых как от людей, так и из объектов окружающей среды.

При этом фагоустойчивость вибрионов, снижение или отсутствие агглютинабельности холерными сыворотками иногда сочетается с вариабельностью по другим признакам (культурально-морфологическим и биохимическим). Штаммы, атипичные по морфологическим признакам, образуют шероховатые, слизистые, мутные и пигментированные колонии. Размер их также может варьировать, вплоть до появления едва видимых карликовых колоний. У таких культур нередко снижена подвижность, наблюдается спонтанная агглютинация в 0,9 %-м растворе натрия хлорида. Отмечена возможность обнаружения в организме больного и в воде открытых водоемов холерных вибрионов в Л-форме. В мазках, сделанных из атипичных культур холерных вибрионов, клетки имеют форму шаров, сферопластов, встречаются вытянутые, извитые, неделящиеся клетки в виде цепей или нитей.

Нередко встречаются штаммы, измененные по биохимическим свойствам, у которых отмечается ослабление, замедление или утрата способности расщеплять углеводы и многоатомные спирты (крахмал, маннит, маннозу, сахарозу), аминокислоты (триптофан, лизин, орнитин) и другие субстраты.

Атипичные культуры холерных вибрионов, обладающие указанными выше признаками рода Vibrio и вида Vibrio cholerae, агглютинирующиеся сывороткой О1 до 1 /₄ титра, лизирующиеся и не лизирующиеся диагностическими монофагами до ДРТ, следует относить к серогруппе О1.

Для всестороннего изучения все атипичные культуры холерных вибрионов следует направлять в специализированные лаборатории.

Для подтверждения принадлежности к V. cholerae О1 слабоагглютинирующихся (ниже 1 /₄ титра), диссоциирующих и фагорезистентных культур обязательным является использование высокочувствительных методов (мультиплексным ПЦР набором праймеров) и, по возможности, реакции агглютинации с кроличьими холерными сыворотками, обладающими большей специфичностью, чем лошадиные, поскольку они не содержат пула неспецифических иммуноглобулинов.

Рекомендуется при изучении измененных по антигенной структуре культур использовать также такие методы, как РНГА, РНАт, иммунофлюоресценцию, преципитацию в геле, адсорбцию агглютининов по Кастеллани, реакцию агглютинации с убитыми кипячением культурами, пробу с комплементом, позволяющую отбирать из популяции измененных штаммов типичные, резистентные к нему клоны в S-форме.

При получении сомнительных результатов слайд-агглютинации с холерной сывороткой О139 серогруппы следует повторить исследование с гретой культурой.

5.4. Учет анализов, оформление направлений и выдача результатов

Ответ о положительном результате может быть предварительным и окончательным.

Предварительный положительный ответ выдают по результатам ускоренного исследования нативного материала и после подращивания его в пептонной воде с помощью иммунофлюоресцентного метода, специфической иммобилизации, РНГА, а также по слайд-агглютинации сыворотками О1 и О139 подозрительных на холерный вибрион колоний. При наличии возможности на этом этапе может быть использована ПЦР со специфическими праймерами.

Предварительный ответ, в случаях проведения срочных анализов, сообщают устно и только при совпадении результатов не менее двух методов.

В условиях эпидемии холеры при проведении массовых исследований после идентификации первых культур такой ответ дает право на проведение противоэпидемических мероприятий.

При проведении массовых исследований в очаге заболеваний холерой, когда первые культуры холерных вибрионов уже были идентифицированы по полной схеме, положительные результаты тестирования в слайд-агглютинации с холерными сыворотками О1 или О139 серогрупп в сочетании с морфологией и подвижностью клеток культур, выделенных от больных диареями или при обследовании на вибриононосительство, следует считать окончательными для решения вопросов о проведении противоэпидемических мероприятий. Достоверность таких результатов повышается при использовании ускоренных методов диагностики: иммунофлюоресцентного, иммобилизации соответствующими сыворотками, ПЦР и др.

Для полной идентификации выделенные культуры передают в назначенную для этих целей группу или лабораторию, специалисты которой при необходимости вносят в ответ соответствующие коррективы и дополнения, касающиеся определения антибиотикограммы, эпидемической значимости и токсигенности.

Не допускается выдавать отрицательные ответы по результатам ускоренного исследования (МФА, РИВ, РНГА, и др.) до окончания анализа как в условиях эпидемии холеры, так и при проведении эпидемиологического надзора.

Схему выдачи ответов см. на рис. 3.

При осуществлении эпидемиологического надзора направление к анализу, а соответственно и ответ на него, оформляют индивидуально на каждого больного. При проведении большого объема исследований в очаге холеры направления к анализам и ответы на них оформляют списком. При обследовании здоровых людей на вибриононосительство и исследовании на холеру объектов окружающей среды групповые формы направления и ответов допускаются как при эпиднадзоре, так и в очаге холеры.

Учет анализов и культур ведут по установленным формам (прилож. 6, 7). Обязательным является ведение рабочих записей идентификации исследования подозрительных культур (прилож. 8), регистрация выделенных культур (прилож. 9), составление паспорта штамма (прилож. 10).

При работе в очаге холеры используют упрощенные формы регистрации анализов, учитывая, что более подробные сведения имеются в бланках направлений, находящихся в лаборатории до ликвидации очага. Для удобства работы направления за каждый день подшивают отдельно.

6. Методы изучения свойств холерных вибрионов

6.1. Серологические методы

Принадлежность холерных вибрионов к О1 или О139 серогруппе определяют в слайд-агглютинации или развернутой реакции агглютинации с холерными агглютинирующими сыворотками О1, Инаба, Огава, РО и с холерной сывороткой О139 серогруппы в соответствии с инструкциями по применению препаратов, а также в других реакциях с иммуноглобулиновыми препаратами, предназначенными для ускоренной диагностики холеры и идентификации возбудителя.

Развернутую реакцию агглютинации ставят и учитывают по общепринятой методике в соответствии с инструкцией по применению диагностических сывороток.

Для исключения спонтанной агглютинации рекомендуется ставить развернутую реакцию в 0,3 %-м растворе NaCl.

Метод дает возможность ускоренно идентифицировать выделенную культуру, а также выявить возбудителя холеры О1 и О139 серогруппы при содержании его в исследуемом материале не менее чем 10 м.к./мл. Исследованию подлежат выделенная культура, нативный материал (испражнения и рвотные массы) и материал после подращивания.

Порядок приготовления мазков, обработка их флюоресцирующими иммуноглобулинами, микроскопия и оценка результатов, являющиеся общими для всех бактерий, описаны в «Наставлениях по применению иммуноглобулинов диагностических флюоресцирующих холерных адсорбированных лошадиных сухих».

При просмотре мазков, обработанных иммуноглобулином холерным флюоресцирующим, особое внимание следует обращать на морфологию светящихся микробов, т.к. в отдельных случаях в мазках из испражнений здоровых людей может наблюдаться свечение микроорганизмов, отличающихся по морфологии от вибрионов (грубые крупные палочки, кокки).

Для устранения неспецифического свечения целесообразно использовать в качестве «гасителя» бычий альбумин, меченый родамином. Методика его использования описана в «Инструкции по применению альбумина бычьего, меченого родамином, сухого».

Реакция иммобилизации вибрионов под влияние м специфических холерных сывороток О1 и О139 серогрупп (РИВ)

Метод дает возможность обнаружить возбудителя в течение нескольких минут при концентрации его в исследуемом материале не менее 10 5 м.к./мл. На предметное стекло пипеткой или петлей наносят 2 капли испражнений, рвотных масс или поверхностного слоя среды обогащения. Первую каплю накрывают покровным стеклом (контроль), ко второй добавляют каплю О1 сыворотки в разведении 1:50, перемешивают и также накрывают покровным стеклом. Раздавленную каплю смотрят под микроскопом при увеличении ×400-600, используя фазово-контрастное устройство или конденсор темного поля.

В случае отрицательного результата необходимо провести аналогичное исследование с холерной сывороткой О139 серогруппы, которую разводят 1:5.

Реакция непрямой гемаггл ютинации (РНГА) с использованием диагностикума эритроцитарного холерного иммуноглобулинового

Порядок подготовки материала, ингредиентов, постановки реакции и ее учет изложены в «Инструкции по применению диагностикума эритроцитарного холерного антительного иммуноглобулинового», прилагаемой к препарату.

6.2. Биохимические свойства

Биохимическую активность холерного вибриона изучают, используя коммерческие среды и тест-наборы или среды лабораторного приготовления, рецептура которых изложена в разделе 7.

а) С помощью реактивов.

Реактивы: 1 %-е водные растворы диметил-пара-фенилендиамина, тетраметил-пара-фенилендиамина (гидрохлорида), этилоксиэтил-пара-фенилендиамина серно-кислого (из набора для обработки бумаги «фотоцвет») и пара-аминодиметиланилина (гидрохлорида или оксалата) в сочетании с 1 %-м спиртовым раствором α-нафтола или без него.

Реактивы должны быть бесцветными, их следует хранить во флаконах из темно-коричневого стекла со стеклянной пробкой без доступа света в холодильнике. В случае помещения реактива во флаконы из светлого стекла их следует обернуть алюминиевой фольгой или темной бумагой.

Не следует ставить пробу на оксидазу с культурами на полиуглеводных средах, а также с колониями на элективных средах (СЭДХ и TCBS).

Учитывая возможную нестойкость реактивов и различную способность вибрионов к образованию оксидазы на различных питательных средах, пробу обязательно сопровождают положительными и отрицательными контролями соответственно с культурами вибрионов или псевдомонад и энтеробактерий, выращенными на используемом в лаборатории питательном агаре.

Определение типа расщепления глюкозы (тест Хью-Лейфсона)

Определение декарбоксилазной и дигидролазной активности

Ферментацию углеводов и многоатомных спиртов (глюкоза, лактоза, манноза, сахароза, арабиноза, маннит, салицин, дульцит, инозит, крахмал и др.) определяют в жидких или полужидких средах Гисса с индикатором бромтимоловым синим, Андреде, ВР.

Определение протеолитических свойств

Определение образования индола

Холерные вибрионы при выращивании в средах, содержащих триптофан (пептонная вода, мясо-пептонный бульон, бульон Хоттингера и др.), расщепляют его с образованием индола, что выявляется с помощью индикаторных бумажек или реактива Эрлиха после инкубирования при температуре (37,0 ± 0,5) °С в течение 18 ч.

Определение образования сероводорода

Использование микротест-систем и СИБ

Для определения оксидазы, образования индола и сероводорода, декарбоксилаз лизина, орнитина, дигидролазы аргинина, ферментации углеводов и многоатомных спиртов при идентификации вибрионов можно также использовать Систему индикаторную бумажную (СИБ) и микротест-ситемы для биохимической идентификации вибрионов.

6.3. Выявление способности к биолюминесценции

6.4. Тесты дифференциации биоваров холерных вибрионов О1

Определение чувствительности к диагностическим холерным фагам

Определение чувствительности к полимиксину В

Постановка реакции гемагглютинации

На предметное стекло в чашке Петри помещают каплю 0,9 %-го раствора хлорида натрия и суспендируют в ней петлей 18-часовую агаровую культуру. Затем добавляют каплю 2,5 %-й взвеси куриных эритроцитов, трижды отмытых 0,9 %-м раствором хлорида натрия. Стекло покачивают до смешивания взвеси эритроцитов и вибрионов. При положительной реакции в течение 1 мин наступает склеивание эритроцитов. Реакцию сопровождают двумя контролями: а) в каплю 0,9 %-го раствора хлорида натрия добавляют каплю 2,5 %-й взвеси эритроцитов; б) в капле 0,9 %-го раствора хлорида натрия суспендируют испытуемую культуру. Контроли должны быть отрицательными. Для постановки пробы могут быть использованы эритроциты морской свинки.

Постановка реакции Фогес-Проскауэра (на ацетилметилкарбинол)

6.5. Тесты межвидовой дифференциации патогенных для человека вибрионов

Определение галофильности вибрионов

К негалофильным относятся V. cholerae и V. mimicus, для роста которых достаточны следовые количества соли в среде. Вибрионы остальных видов, за исключением некоторых штаммов V. fluvialis и V. metshnikovii не растут в 1 %-й пептонной воде без добавления натрия хлорида и устойчивы к значительным его концентрациям.

Определение способности вибрионов к росту при разных температурах

а) Суточную агаровую культуру засевают в 1 мл бульона Хоттингера с 0,1 % азотно-кислого калия. После 2-х суток инкубации при температуре (37,0 ± 0,5) °С в посевы добавляют 0,5 мл реактива Грисса. В положительных случаях среда сразу же окрашивается в красный цвет.

6.6. Оценка эпидемической значимости холерных вибрионов

Методика определения гемолитической активности описана выше.

Источник