мук 3016 12 статус на 2021 год
1. Назначение и область применения
1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы санитарно-паразитологической экспертизы плодоовощной, плодово-ягодной и растительной продукции на соответствие установленным требованиям санитарно-эпидемиологической безопасности.
1.2. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы другими испытательными лабораториями, аккредитованными в установленном порядке.
2. Нормативные ссылки
2.1. Федеральный закон Российской Федерации от 21.11.2011 № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации».
2.2. Федеральный закон Российской Федерации от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2.3. Федеральный закон Российской Федерации от 2.012000 № 29-ФЗ «О качестве и безопасности пищевых продуктов».
2.4. Федеральный закон Российской Федерации от 26.12.2008 № 294-ФЗ «О защите прав юридических лиц и индивидуальных предпринимателей при осуществлении государственного контроля (надзора) и муниципального контроля».
2.6. Постановление Правительства Российской Федерации от 14.12.2009 № 1009 «О порядке совместного осуществления Министерством здравоохранения и социального развития Российской Федерации и Министерством сельского хозяйства Российской Федерации функций по нормативно-правовому регулированию в сфере контроля за качеством и безопасностью пищевых продуктов и по организации такого контроля».
2.7. Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 19.07.2007 № 224 «О санитарно-эпидемиологических экспертизах, обследованиях, исследованиях, испытаниях и токсикологических, гигиенических и иных видах оценок».
2.8. Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 17.03.2008 № 88 «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней».
2.9. СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».
2.10. Решение Комиссии Таможенного союза от 09.12.2011 № 880 «О принятии технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011).
2.11. Решение Комиссии Таможенного союза от 09.122011 № 882 «О принятии технического регламента Таможенного союза «Технический регламент на соковую продукцию из фруктов и овощей» (ТР ТС 023/2011).
2.12. Федеральный закон от 27.10.2008 № 178-ФЗ «Технический регламент на соковую продукцию из фруктов и овощей».
2.14. СанПиН 3.2.1333-03 «Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации».
2.16. СП 1.1.2193-07 «Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно-эпидемиологических (профилактических) мероприятий». Изменения и дополнения 1 к СП 1.1.1058-03.
2.17. ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2006 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий».
2.18. ГОСТ 26313-84 «Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб».
2.19. МУ 3.2.1756-03 «Эпидемиологический надзор за паразитарными болезнями».
2.20. МУК 4.2.2661-10 «Методы санитарно-паразитологических исследований».
2.21. МУК 4.2.2314-08 «Методы санитарно-паразитологического анализа воды».
3. Правила отбора проб для санитарно-паразитологических исследований
Правила отбора проб (образцов) плодоовощной, плодово-ягодной и растительной продукции устанавливаются с целью санитарно-эпидемиологической экспертизы продукции и определения степени ее контаминации яйцами и личинками гельминтов, а также цистами (ооцистами) кишечных простейших.
3.1. Отбор проб для лабораторных исследований производится методом случайной выборки. Объединенная проба формируется методом отбора трех точечных проб от каждой фиксированной партии однородной продукции.
3.2. Пробы свежих и свежемороженых зелени столовой, овощей, фруктов и ягод отбираются в чистые емкости (чистые полиэтиленовые пакеты или другие упаковочные материалы, разрешенные для контакта с пищевой продукцией).
3.3. Объем пробы плодов, овощей составляет по 0,5 кг с каждых 100 кг продукции.
3.4. Объем объединенной пробы столовой зелени, листовых овощей и грибов, выращенных в тепличных условиях, должен составлять не менее 0,1 кг из каждой потребительской тары.
3.5. Отбор проб ягодной продукции проводят по 0,2 кг с каждых 100 кг продукции.
3.6. Отбор проб свежеотжатых соков проводят в объеме 0,1 л.
3.8. Отбор проб методом смывов допускается с плодов и бахчевых культур крупных размеров с гладкой поверхностью; проводится на месте выемки проб двумя методами: методом простых смывов; методом инструментальных смывов.
3.9. Результаты лабораторных исследований оформляются в виде протоколов исследований (испытаний).
Объемы проб плодоовощной, плодово-ягодной и растительной продукции для проведения санитарно-паразитологических исследований представлены в табл. 1.
Отбор проб свежих и свежемороженых плодов, овощей, ягод и столовой зелени
Объем, вес объединенной пробы для исследования
Грибы, выращенные в тепличных условиях
Не менее 0,1 кг из каждой потребительской тары.
Отбор проб капусты, салатов допускается с поверхностных (прикорневых) листьев
Не менее 0,5 кг с каждых 100 кг продукции
По 0,2 кг с каждых 100 кг продукции
Плоды бахчевых культур крупных размеров с гладкой поверхностью
4. Условия хранения проб
4.2. Образцы свежезамороженной продукции хранят при температуре морозильной камеры в соответствии с маркировкой на этикетке. Размораживание и повторное замораживание продукции в процессе хранения в лаборатории не допускается.
4.3. Пробы плодоовощной, плодово-ягодной и растительной продукции после исследования возвращаются заказчику, либо утилизируются.
5. Оборудование и реактивы
Пробоотборник-концентратор гидробиологический (аппарат «ПробоКонГ») (или аналоги)
Отборник флотанта фильтрующий «ОФФ-25»
Вакуумные фильтровальные установки ПВФ-142, ПВФ-35, ПВФ-47
Приборы напорного фильтрования ПНФ, УППВ (или аналоги)
Термоконтейнер для транспортирования свежей и свежемороженой продукции
Термометр для контроля температуры внутри холодильного шкафа, холодильника бытового, морозильной камеры
Весы лабораторные механические равноплечие с наибольшим пределом взвешивания 1000 г, с допустимой погрешностью не более 0,1 г с разновесами или электронные весы с наибольшим пределом взвешивания 200 г, с допустимой погрешностью не более 0,01 г
Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды не ниже требований
Ареометры с пределами измерений от 1,000 до 1,400 кг/м 3
Световые микроскопы, оснащенные окулярами с увеличением ´ 10 (дополнительно могут быть ´ 7, ´ 5), объективами ´ 10, ´ 40, ´ 100, окуляр-микрометр и объект-микрометр
Мембранные фильтры на основе ацетатов целлюлозы с размерами пор от 2,5 до 5,0 мкм, МФАС-СПА
Прозрачные трековые мембраны ATM на основе полиэтилентерефталата с размерами пор от 1,0 до 5,0 и более мкм
Диаметр фильтровальных дисков 25, 35, 47, 70 и до 142 мм, в зависимости от диаметра фритты фильтродержателя используемого фильтровального оборудования
Посуда лабораторная стеклянная:
Пробирки (многоразового или одноразового использования)
Цилиндры, вместимостью 100, 250, 500 мл или мензурки, вместимостью 250, 500, 1000 мл
Чашки бактериологические (Петри)
Пипетки, вместимостью 1, 2, 5, 10 мл с ценой деления 0,1 мл (многоразового или одноразового использования)
Флаконы стеклянные или пластиковые (одноразовые) емкостью: 5, 100, 200, 500 и 1000 мл
Банки (широкогорлые) объемом более 2000 мл и высокие кюветы для замачивания продукции и т.п.
Пинцеты, кисточки акварельные (широкие, мягкие, полужесткие, жесткие)
Моющее жидкое средство.
Примечание: Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными характеристиками, но не ниже указанных.
Натрий хлористый (NaCl)
Нитрат натрия (NaNO 3 )
Нитрат калия (КNO 3 )
Хлорид цинка (ZnCl 2 )
Сульфат цинка (ZnSO 4 )
Сульфат магния (MgSO 4 )
40 % раствор формалина
1 % и 2 % водный раствор Люголя
6. Подготовка проб к исследованию на наличие яиц гельминтов, личинок и цист (ооцист) кишечных патогенных простейших
6.1.3. Через 2 ч исследуемые пробы обмывают щетками или кисточками в зависимости от размера образца и состояния их поверхности. Плоды и овощи с шероховатой поверхностью обмывают тщательно. Столовую зелень тщательно прополаскивают.
6.1.4. Исследуемые пробы удаляют из воды.
6.1.5. Промывную воду отстаивают 60 мин.
6.1.6. Надосадочную жидкость осторожно сливают в центрифужные пробирки и исследуют по методу исследования смывов без применения флотационных растворов.
6.1.7. Образовавшийся осадок в зависимости от объема переносят в центрифужные пробирки объемом 10 мл или 250 мл и исследуют одним из методов:
· с применением флотационных растворов;
· методом иммуномагнитной сепарации (ИМС) с последующим иммунофлуоресцентным мечением на обнаружение ооцист криптоспоридий и цист лямблий;
* Метод разработан для качественного определения ооцист криптоспоридий в исследуемых образцах, в последующем возможно использование в методе ПЦР новых праймеров с возбудителями гельминтозов и протозоозов.
6.1.8. При интенсивном почвенном загрязнении проб образовавшийся осадок переносят в центрифужные пробирки объемом 250, 80, 100 мл (по объему исходного материала) и исследуют по методу исследования почвы.
Метод простых смывов применяется для исследования крупных плодов, овощей и бахчевых культур на месте отбора проб.
6.2.1. Для каждого образца исследуемых продуктов от партии берут отдельные пробирку и кисточку, которые нумеруют соответственно записи в акте отбора проб.
6.2.4. После отбора смывов кисточку тщательно ополаскивают и складывают в отдельную емкость для последующей обработки в лабораторных условиях.
6.2.5. Центрифужные пробирки со смывами закрываются плотно пробками и доставляются в лабораторию для исследования по методу исследований смывов без применения флотационных растворов.
Метод предназначен для исследования плодоовощной, плодово-ягодной и растительной продукции от партии больших объемов (вагоны, фуры и т.п.) или продукции крупных размеров на месте отбора проб.
6.3.2. Выходной и сбросовый шланги прибора направить в ёмкость, закрепив их на его стенке при помощи прищепки.
6.3.3. Включить насос прибора «ПробоКонГ» по схеме рециркуляции в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.
6.3.4. По инструкции по эксплуатации прибора нанести на опорную сетку порошковый фильтр ПФГ, установить по манометру давление 0,5 атм и положить в ёмкость часть данной пробы овощей, плодов, бахчевых в таком количестве, чтобы они достаточно интенсивно омывались моющим раствором. При данном режиме работы аппарата интенсивный поток моющего раствора проходит, в основном, через сбросовый шланг и моет овощи, фрукты в течение 10 мин. Через 10 мин, не прерывая работу прибора, вынуть из ёмкости эту часть пробы и загрузить следующую часть на 10 мин.
Повторять эту операцию до тех пор, пока вся данная проба продукции не будет помыта.
6.3.5. Записать показания водосчётчика.
6.3.6. Прибор переключить в режим фильтрования, для этого по манометру нужно установить давление примерно 3 атм. В этом режиме поток моющего раствора проходит в основном через намывной фильтр ПФГ.
6.3.8. Остановить фильтрование и отобрать концентрат для лабораторного исследования по инструкции к прибору.
6.3.9. Полученный концентрат обрабатывать и анализировать по МУК 4.2.2314-08 как концентрат воды, полученный методом порошковой фильтрации (например, при помощи прибора «ПробоКонГ»).
6.4.1. Перед проведением исследования свежеотжатые соки, нектары, напитки разбавляются дистиллированной водой в соотношении 1:1.
6.4.2. Полученную смесь разливают в центрифужные пробирки объемом 10, 80, 100, 250 мл (по объему исходного материала) и далее исследуют одним из методов:
· с применением флотационных растворов;
· по методу фильтрации с использованием прозрачных трековых мембран;
· методом, иммуномагнитной сепарации (ИМС) с последующим иммунофлуоресцентным мечением на обнаружение ооцист криптоспоридий и цист лямблий;
* Метод разработан для качественного определения ооцист криптоспоридий в исследуемых образцах, в последующем возможно использование в методе ПЦР новых праймеров с возбудителями гельминтозов и протозоозов.
7. Методы исследования проб на яйца и личинки гельминтов, на цисты (ооцисты) кишечных простейших
7.1. Метод исследования осадка с применением флотационных растворов
7.1.1. В центрифужные пробирки с осадком проб приливают 3 % раствор щелочи (NaOH или КОН) в соотношении 1:2, тщательно перемешивают стеклянными палочками и оставляют на 30 мин.
Кол-во вещества (г) на 1 л воды
Удельный вес, плотность раствора
Нитрат аммония (аммиачная селитра)
Тиосульфат натрия (гипосульфит)
Нитрат натрия + нитрат калия (раствор Брудастова)
* Реактивы растворяют в горячей воде
7.1.3.1. Приготовление флотационных растворов
Б) Раствор нитрата аммония, или гранулированной аммиачной селитры, с плотностью 1,3 готовят таким же способом, что и предыдущий раствор, из расчета 1500 г соли на 1 л горячей воды.
Г) Раствор тиосульфата натрия (гипосульфита натрия Na 2 S 2 O 3 5Н2O ) плотностью 1,4 готовят из расчета 1750 г вещества на 1 л воды.
Образующийся на дне сосуда осадок используют при следующем приготовлении насыщенного раствора.
7.1.5. Поверхностную пленку снимают покровным стеклом, переносят висячую каплю на предметное стекло и микроскопируют при увеличении: окуляр ´ 10, ´ 40.
7.1.6. При исследовании на цисты кишечных простейших перед переносом висячей капли на предметное стекло наносят каплю 1 % раствора Люголя.
7.2. Метод исследования смывов без применения флотационных растворов
7.2.1. Пробирки со смывами проб центрифугируют при 1500 об./мин в течение 5 мин.
7.2.2. Надосадочную жидкость удаляют.
7.2.3. Осадок переносится на предметное стекло.
7.2.4. Микроскопировать при увеличении окуляр ´ 10, объектив ´ 10, ´ 40.
7.2.5. При исследовании на цисты кишечных простейших в препарат вносят каплю 1 % раствора Люголя.
7.3. Метод исследования осадка с интенсивным почвенным загрязнением
7.3.1. В центрифужные пробирки с осадком приливают 3 % раствор щелочи (NaOH, КОН) в соотношении 1:1.
7.3.3. Пробирки с осадком центрифугировать в течение 5 мин при 800 об/мин.
7.3.4. Надосадочную жидкость удалить.
7.3.8. Поверхностную пленку снимают покровным стеклом, висячую каплю переносят на предметное стекло.
7.3.9. Микроскопируют при увеличении: окуляр ´ 10, объектив ´ 10, ´ 40.
7.3.10. При исследовании на цисты кишечных простейших перед переносом висячей капли на предметное стекло наносят каплю 1 %-го раствора Люголя.
7.4. Метод фильтрации с использованием прозрачных трековых мембран
7.4.2.2. Закрепить воронку или диск прибора и провести фильтрацию раствора сока в соответствии с инструкцией к прибору.
7.4.2.3. После окончания фильтрования мембраны ATM осторожно снять пинцетом с фильтродержателя и перенести на предметное стекло. На поверхность предметного стекла предварительно нанести 50 %-й раствор глицерина в виде тонкого слоя.
7.4.2.4. Сверху мембраны нанести каплю 1 %-го раствора Люголя и накрыть покровными стеклами всю поверхность мембраны.
* Примечание : Для плотного (без складок) прилегания ATM к фритте рекомендуется ATM вместе с калькой уложить мембраной на фритту и провести ладонью несколько раз по кальке. За счет появления электростатики мембрана прилипнет к фритте, а калька легко отделится от мембраны.
7.5. Методы полимеразно-цепной реакции (ПЦР)
Все представленные методы являются качественными для определения ооцист криптоспоридий и состоят из следующих этапов: выделение ДНК, амплификация целевой ДНК с соответствующими праймерами, электрофорез продуктов амплификации в агарозном геле, документирование и анализ результатов.
Исследования могут быть выполнены на стандартном оборудовании с использованием стандартного набора реагентов в любой ПЦР-лаборатории.
Амплификатор типа «Терцик МС-2» со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 °С/с.
Прибор для горизонтального электрофореза типа «Sub Cell GT System» с комплектом кювет и гребенок
Холодильник бытовой электрический
Камера морозильная, обеспечивающая температуру минус 20 °С
Печь микроволновая (мощностью не менее 400 W)
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г
Анализатор потенциометрический, погрешность измерений рН = 0,01
Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные.
Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды по ГОСТ 6709-72
Гомогенизатор перистальтического типа «Стомайкер» или других моделей
Облучатель бактерицидный настенный
ОБН-150 или других видов
Фотопленка «Микрат Изопан»
Дозаторы с переменным объемом дозирования:
Примечание : Допускается использование другой аппаратуры и инструментов с аналогичными техническими характеристиками, но не хуже указанных.
Бумага фильтровальная лабораторная
Мембраны Millipore 0,4 мкм
Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические, вместимостью 25, 50, 100, 200, 1000 мл
Цилиндры стеклянные мерные лабораторные, вместимостью 25, 100, 1000 мл
Пробирки микроцентрифужные типа
Эппендорф, вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 мл
Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до: 10; 20; 200; 1000 мм 3 ; 10 см 3
Набор Diatom DNA Prep 100/200
Примечание : Допускается использование другой лабораторной посуды и материалов с аналогичными техническими характеристиками.
Кислота соляная, хч
Натрия гидроокись, чда
Натрий хлористый, хч
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), хч
Гексадецилтриметиламмоний бромид (СТАВ)
Корпорация «Сигма Олдрич» (Sigma) кат. № Н 5882
Трис (оксиметил) аминометан, хч
Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА)
«Сигма Олдрич» (Sigma) кат. № В 4287
Этидий бромистый, хч
Спирт этиловый ректификованный
Спирт изопропиловый, хч
Масло вазелиновое медицинское
Буфер для ПЦР с MgCl 2 «Сигма Олдрич» (Sigma) кат. № Р 2192
Агароза для электрофореза (тип П). «Сигма Олдрич» (Sigma) кат. № А 6877
Маркер молекулярной массы ДНК. «Сигма Олдрич» (Sigma) кат. № Р 1473
Примечание : Допускается использование других реактивов с аналогичными техническими характеристиками, имеющих международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000.
7.5.4.2. Приготовление 5 М NaCl.
Растворить 29,22 г натрия хлористого (молекулярная масса 58,5) в 100 мл дистиллированной воды, перемешать, хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.
7.5.4.3. Приготовление 30 % NaOH.
Растворить 3 г натрия гидроокиси (молекулярная масса 40) в 7 мл дистиллированной воды.
7.5.4.4. Приготовление 0,5М ЭДТА (рН 8,0).
7.5.4.5. Приготовление хлороформа, насыщенного водой.
7.5.4.6. Приготовление 70 %-го раствора этилового ректификованного спирта.
7.5.4.7. Приготовление раствора БСА (20 мкг/мл).
Растворить 0,002 г сухого альбумина бычьего сывороточного в 1 мл деионизированной воды, 10 мкл полученного раствора смешать с 990 мкл деионизированной воды.
7.5.4.8. Приготовление лизирующего буфера (2 % раствора «СТАВ»).
· Перед использованием раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате при температуре 65 °С до полного растворения осадка.
· Непосредственно перед использованием в приготовленный лизирующий буфер вносят меркаптоэтанол из расчета 4 мм 3 на 1 см 3 лизирующего буфера и перемешивают.
7.5.4.9. При проведении электрофореза использовать один из ниже перечисленных буферов:
А) Приготовление 1х ТВБ буфера для электрофореза.
В мерной колбе на 1000 мл растворить 10,8 мг Трис (оксиметил) аминометана, 5,5 г борной кислоты и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, довести дистиллированной водой до метки, перемещать до полного растворения.
Б) Приготовление 1х ТАЕ буфера для электрофореза.
В мерную колбу вместимостью 1000 мл внести 242 г Трис-основания, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0,5 М ЭДТА, долить деионизованной водой до метки. Полученный 50х раствор перед употреблением развести в 50 раз.
Использовать для проведения электрофореза не более двух раз.
Растворить 1 г бромистого этидия в 100 мл дистиллированной воды.
Г) Приготовление 2 % раствора агарозного геля
Приготовление рабочего раствора солевого буфера
7.5.5.1. Содержимое флакона с 10-кратным солевым буфером, 10 мл, перенести в мерный цилиндр, довести бидистиллированной водой до метки 100 мл, и 96 %-м этиловым спиртом до метки 300 мл и перемешать. Готовый рабочий раствор солевого буфера хранить в герметично закрытой посуде при температуре 4 °С.
7.5.5.4. После термостатирования центрифугировать пробирку со смесью 10 с при 5000 об./мин в том случае, если смесь содержит несолюбилизированный клеточный дебрис или другой нерастворимый осадок. Прозрачный супернатант целиком перенести в чистую пробирку.
7.5.5.5. В пробирку с чистой смесью добавить 20 мкл суспензии сорбента NucleoS™ (перед использованием N ucleoS™ следует интенсивно встряхнуть на вортексе).
7.5.5.7. Центрифугировать 10 с при 5000 об./мин.
7.5.5.8. Осторожно, не задевая осадка, удалить супернатант.
7.5.5.9. К осадку добавить 200 мкл лизирующего реагента, тщательно перемешать на вортексе до гомогенного состояния.
Примечание : Если суспендирование затруднено (при большой нагрузке ДНК из-за сильного слипания сорбента), то осадок необходимо вначале осторожно перемешать пипетированием, а затем перемешать на вортексе.
7.5.5.10. Добавить в пробирку 1 мл рабочего раствора солевого буфера.
7.5.5.13. Осторожно, не задевая осадка, удалить супернатант.
7.5.5.15. Повторить положение 7.5.5.14.
7.5.5.19. Еще раз суспендировать содержимое пробирки на вортексе перед центрифугированием.
7.5.5.20. Центрифугировать 1 мин при 10000 об./мин.
7.5.6.1. Общие требования к постановке идентификационной ПЦР.
При проведении идентификации обязательно готовят следующие пробы:
A) ДНК-матрица положительного контроля с праймерами к соответствующим возбудителям.
Б) ДНК-матрица отрицательного контроля с праймерами к соответствующим возбудителям.
B) ДНК-матрица отрицательного контроля с теми же праймерами.
Г) Исследуемые образцы ДНК паразитов с праймерами.
7.5.6.2. Метод идентификации ДНК.
А) В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 3.
Объем реакционной смеси 30 мкл
Объем реакционной смеси 50 мкл
Буфер для полимеразной цепной реакции с MgCl2 (10х)
Taq-полимераза (5 ед./мкл)
Примечание : Реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Б) Подготовка к проведению амплификации:
· реакционную смесь разлить в каждую пробирку для проведения ПЦР по 18 мкл;
· в каждую пробирку с 18 мкл добавить 2 мкл раствора ДНК;
· смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3 000 об./мин);
· при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Количество циклов амплификации
В) После проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле
7.5.7.1. Приготовление агарозного геля:
А) Для приготовления 2 %-й агарозы необходимо к 1 г агарозы добавить 50 мл 1х буфера ТВЕ и тщательно перемешать.
В) Расплавленную агарозу охладить до 56 °С и добавить 5 мкл бромистого этидия (концентрация 10 мг/мл), тщательно перемешать.
7.5.7.2. Проведение электрофореза.
Г) Гель (без формы) поместить на фильтр трансиллюминатора и посмотреть в проходящем ультрафиолетовом свете.
7.6. Метод иммуномагнитной сепарации (ИМС) с последующим иммунофлуоресцентным мечением на обнаружение ооцист криптоспоридий и цист лямблий
Наконечники для автоматических пипеток
Градуированная пипетка на 10 мл
Пробирки для иммуномагнитной сепарации (ИМС-пробирки или плоскостенные пробирки)
Пробирки типа Эппендорф на 1,5 мл
Штатив для ИМС-пробирок
Штатив для пробирок типа Эппендорф
Флюоресцентный микроскоп с набором необходимых фильтров и принадлежностей в рекомендованной комплектации
Слайды SuperStick™: S100-1 (одно окно), S 100-2 (два окна), S100-3 (три окна)
Моющий буфер Grab™ Buffer В (4)
Таблетированный фосфатный буфер PBS (6)
DAPI концентрированный раствор (7), 2 мг/мл
Моющий буфер SureRinse™ (8)
Иммунореагент Aqua-Glo™G/C (9) в рабочем разведении
Положительный контроль (10)
Контрастирующий краситель (11), С101
0,1 Н раствор соляной кислоты
Примечание : Допускается использование материалов, оборудования и реактивов иных производителей с аналогичными характеристиками, но не ниже указанных.
После фильтрации смыва с овощей осадок с фильтров смывают в 10 мл дистиллированной воды, переливают в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при 1500 об./мин. Удаляют надосадочную жидкость и осадок исследуют. При этом осадок должен быть не более 1 мл. Если получился большой объем осадка, его необходимо ресуспендировать дистиллированной водой.
В одной ИМС-пробирке обрабатывается не более 0,5 мл концентрата пробы, ресуспендированного в 3 мл дистиллированной воды. Больший объем осадка необходимо перемешать с дистиллированной водой, разделить на части, в каждой из которых должно содержаться не более 0,5 мл исходного осадка, и далее обрабатывать как две и более пробы.
Примечание : диагностические наборы с иммунореагентами и буферными растворами перед использованием выдержать в течение одного часа при комнатной температуре.
7.6.3.1. С помощью градуированной пипетки на 10 мл, предварительно омытой дистиллированной водой, перенести в пробирку для иммуномагнитной сепарации (ИМС-пробирку или плоскостенную пробирку) исследуемый концентрат, ресуспендированный в 3 мл дистиллированной воды. Омыть пробирку, в которой находился концентрат, двумя порциями дистиллированной воды по 1 мл, оба смыва перенести в пробирку для иммуномагнитной сепарации. Общий объём раствора в пробирке для ИМС составит 5 мл.
7.6.3.2. Внести в пробирку для ИМС 5 мл 2-концентрированного буфера Grab™ Buffer A(1). Плотно закрыть крышку пробирки и перемешать раствор, переворачивая пробирку 3 раза. По выполнении всех процедур переноса пробы общий объем раствора в ИМС-пробирке составляет 10 мл.
7.6.3.3. Перемешать иммуномагнитную суспензию Giardia-Grab™ IMS Beads (2) на вортексе в течение 20 с, отобрать 100 мкл суспензии и перенести ее в ИМС-пробирку, в которой уже находится проба. Перемешать иммуномагнитную суспензию Crypto-Grab™ MS Beads (3) на вортексе в течение 20 с, отобрать 100 мкл суспензии и перенести ее в пробирку для ИМС, в которой уже находится проба. Закрепить пробирку для ИМС в штативе лабораторного ротатора перпендикулярно к оси вращения. Перемешивать в течение одного часа при скорости 18 об./мин при комнатной температуре.
7.6.3.4. Извлечь ИМС-пробирку из ротатора. Поместить ее в магнитный штатив плоской стороной к магниту. Бережно покачивать штатив с пробиркой вручную в течение 3 мин, поворачивая ее на 90 градусов от себя/на себя, при этом плоская сторона пробирки должна находиться снизу.
7.6.3.5. Остановив покачивание в вертикальном положении пробирки и не вынимая ее из магнитного штатива, осторожно вылить надосадочную жидкость из пробирки. Не вынимая ИМС-пробирку из штатива и не касаясь магнитного осадка на стенке, отобрать остатки жидкости со дна пробирки с помощью пастеровской пипетки.
7.6.3.6. Извлечь пробирку из штатива, добавить в пробирку 0,48 мл. буфера Grab™ Buffer В (4). Поворачивая пробирку, осторожно смыть суспензию с плоской стенки. С помощью пастеровской пипетки омыть плоскую стенку пробирки.
7.6.3.7. С помощью пастеровской пипетки перенести 0,48 мл суспензии в пробирку типа Эппендорф на 1,5 мл. Дважды омыть плоскую стенку ИМС-пробирки 0,48 мл буфера Grab™ Buffer В, осторожно поворачивая пробирку и используя ту же пастеровскую пипетку. Последовательно перенести оба смыва в пробирку типа Эппендорф на 1,5 мл с помощью одной пастеровской пипетки, при этом избегать образования пузырей. Подождать примерно 15 с и перенести остатки жидкости из ИМС-пробирки в ту же пробирку типа Эппендорф.
7.6.3.8. Закрыть крышку пробирки типа Эппендорф и поместить её в магнитный штатив. Бережно покачивать штатив с пробиркой вручную в течение 1-й минуты, поворачивая ее на 180 градусов от себя/на себя, при этом пробирка должна находиться сверху.
7.6.3.9. Не вынимая пробирку типа Эппендорф из магнитного штатива и не касаясь суспензии на стенке пробирки, с помощью пастеровской пипетки осторожно отобрать всю жидкость из пробирки
7.6.4.2. Инкубировать пробирку в течение 10 мин при комнатной температуре.
7.6.4.3. Перемещать суспензию в микроцентрифужной пробирке на вортексе в течение 30 с.
7.6.5.1. Растворить 1 таблетку таблетированного фосфатного буфера (6) в 100 мл дистиллированной воды.
7.6.5.2. Приготовить рабочий раствор DAPI: развести 1 мкл 5000х-концентрированного раствора (7) из комплекта поставки в 5 мл готового фосфатного (PBS) буфера. Рабочий раствор DAPI необходимо готовить в день выполнения исследования. Использовать только свежеприготовленный рабочий раствор DAPI. Избегать воздействия прямого солнечного света.
Примечание: для фиксации цист и ооцист на слайде внести в каждое окно слайда по 45 мкл абсолютного метанола и высушить (примерно 30 мин). После фиксации метанолом интенсивность флуоресценции DAPI возрастает.
7.6.6. Флуоресцентное и иммунофлуоресцентное мечение
7.6.6.2. Внести одну каплю (ок. 45 мкл) иммунореагента Aqua-Glo™ G /C (9) в окна слайда. При необходимости, с помощью аппликатора или стеклянной палочки распределить реагент по лунке. Не касаться поверхности окна!
7.6.6.3. Поместить препараты в ячейку влажности и инкубировать не менее 25 мин при 37 °С или не менее 40 мин при комнатной температуре. Допускается более длительное время инкубации.
7.6.6.5. Разложить препараты на наклонном штативе для слайдов, подсушить в токе теплого воздуха.
7.6.6.6. Нанести 1 каплю защитной среды (12) No- Fade ™ в каждую лунку. Нанести покровное стекло. Заклеить бесцветным лаком.
Примечание : Меченные препараты должны храниться в темноте при температуре (5 ± 3) °С. Не допускать замораживания! Меченные препараты, защищенные средой No-Fade™, могут храниться при температуре (5 ± 3) °С в течение по крайней мере 6 месяцев.
Исследуют препараты не менее чем при 200-кратном общем увеличении на наличие яблочно-зеленой флюоресценции, микроскопируя все поля зрения лунки слайда. При использовании каждой новой партии реагентов и перед началом микроскопии препаратов исследуемых проб следует предварительно просмотреть препарат положительного контроля, для чего используется контрольная суспензия с точно подсчитанными цистами лямблий и ооцистами криптоспоридий прилагаемая в диагностическом наборе.
8. Методы исследования проб на наличие личинок гельминтов
8.1. Подготовка к исследованию
Столовую зелень, листовые овощи (другую растительную продукцию) по методу замачивания готовят к исследованию. Полученные смывные воды исследуются на наличие личинок нематод (стронгилид, анкилостомид) по методу Бермана или по методу Бермана в модификации Супряги.
8.2. Метод Бермана
Стеклянная воронка (диаметром 10 см)
Металлическое сито или сетка «мельничный газ»
Резиновая трубка с зажимом
Стеклянные или деревянные палочки
Собрать аппарат Бермана, для чего закрепить в штативе стеклянную воронку с металлическим ситом. На нижний конец воронки надеть резиновую трубку с зажимом.
8.2.3.2. Сетку с пробой осадка приподнять и в воронку налить воду таким образом, чтобы нижняя часть сетки с калом была погружена в воду.
8.2.3.3. Через 24 ч зажим на резиновой трубке быстро открыть и жидкость спустить в центрифужную пробирку.
8.2.3.5. Надосадочную жидкость быстро слить.
8.2.3.6. Осадок нанести на предметное стекло или в чашку Петри.
8.2.3.7. Можно спустить жидкость в чашку Петри и исследовать без центрифугирования с использованием МБС. При обнаружении личинок для их обездвиживания внести одну каплю 2 % раствора Люголя, личинку перенести на предметное стекло и прикрыть покровным.
8.2.3.8. Микроскопировать при увеличении: объектив ´ 8 или ´ 10, окуляр ´ 7 или ´ 10, уточнение морфологического строения при увеличении: объектив ´ 40, окуляр ´ 10.
8.3. Метод Бермана в модификации Супряги
Стереоскопический микроскоп МБС
8.3.2.2. Залить теплой (40 °С) дистиллированной водой, чтобы проба осадка была полностью покрыта.
8.3.2.5. Слить осторожно надосадочную жидкость, осадок поместить в чашку Петри.
8.3.2.6. Исследовать осадок в чашке Петри под бинокулярным стереоскопическим микроскопом МБС (с нижней подсветкой), объектив ´ 2, окуляр ´ 12, ´ 14; обращая внимание на подвижных, слабоподвижных и неподвижных личинок.
8.3.2.7. Неподвижные личинки микроскопируют при увеличении: объектив ´ 8, ´ 10 и ´ 40; окуляр ´ 10.
8.4. Метод Корта
Применяется для идентификации личинок паразитических нематод от свободноживущих.
Принцип метода Корта заключается в воздействии на личинок нематод формалином. При этом личинки свободноживущих нематод погибают быстрее, чем паразитические.
8.4.1.1. Жидкость с личинками поместить в чашку Петри или на часовое стекло.
8.4.1.2. Добавить 40 %-й раствор формалина к жидкости с личинками нематод в соотношении 1: 5.
Примечание : При добавлении формалина в соотношении 1:25 к жидкости с личинками свободноживущие гибнут через 12 мин, а паразитические личинки остаются подвижными.
Список литературы
1. Романенко Н.А., Падченко И.К., Чебышев Н.В. Санитарная паразитология. М.: Медицина, 2000, 319 с.