методика отбора проб мяса для бактериологического исследования
Бактериологическое исследование мяса и мясных продуктов (схема исследования).
Бактериологическое исследование мяса и мясных продуктов по выявлению обсеменения их бактериями рода сальмонелла, а также условно патогенными бактериями, стафилококками, стрептококками и анаэробами проводят по ГОСТ 21237-75. «Мясо. Методы бактериологического анализа».
Бактериологически исследуют мясо и мясопродукты в следующих случаях:
1)при наличии подозрения на инфекционные заболевания;
2)при септико-пиэмических заболеваниях животного;
3)при заболеваниях, связанных с тяжелыми родами;
4)при желудочно-кишечных заболеваниях животного;
5)при осложненных травматических заболеваниях;
6)при истощении или понижении температуры тела;
7) при удалении кишечника из туши позднее двух часов после убоя;
8) при отсутствии ветеринарно-санитарного документа на мясо.
Для правильного проведения бактериологического исследования от мясной туши нужно взять следующие пробы:
1) два куска кубической формы, весом по 200 г (один кусок берут из сгибателя или разгибателя передней конечности, другой от сгибателя или разгибателя задней конечности противоположной стороны);
2) два лимфоузла туши, взятых вместе с окружающей их жировой тканью и без надрезов (порядок взятия такой же, как и проб мяса);
3)одну почку без надрезов;
4)селезенку;
5)кусок печени (лучше с желчным пузырем);
6) трубчатую кость (целиком нераздробленную).
При взятии для пробы части органа необходимо прижигать поверхность разрезов. Для бактисследования на сибирскую язву следует брать в качестве проб пораженный лимфоузел и кусок измененной ткани.
Чтобы предохранить взятые пробы от загнивания (если исследование их задерживается), куски мяса с поверхности обугливают на пламени; лимфатические узлы и трубчатую кость погружают в денатурированный спирт и вынув обжигают также на пламени. Место отреза кусков органов следует прижечь раскаленным ножом, а затем весь кусок погрузить в спирт и обжечь.
В случае отправки проб на то или иное расстояние в лабораторию каждую пробу отдельно завертывают в фильтровальную бумагу и нумеруют. Затем все пробы упаковывают в плотную тару и пересыпают соломенной резкой. В сопроводительном документе к пробам нужно указать: вид животного, название владельца продукта, какие пробы направляются, предположительный диагноз, на какой предмет направляется материал. Для предохранения от порчи во время бактериологического исследования тушу необходимо хранить при температуре не выше 4 град.
При исследовании соленого мяса, находящегося в бочечной таре, берут образцы мяса и имеющиеся лимфатические узлы сверху, из середины и со дна бочки, а также, при наличии, трубчатую кость. Пробы заворачивают в вощаную или пергаментную бумагу, наклеивают этикетки, нумеруют, заворачивают в общий пакет, перевязывают шпагатом, пломбируют или опечатывают сургучной печатью.
Из присланного в лабораторию материала готовят мазки-отпечатки по общепринятой методике, окрашивают по Граму и микроскопируют их, а также проводят посев на мясопептонный агар. Для идентификации и выделения чистой культуры сальмонелл в лабораториях широко используют среды накопления (селенитовая и магниевая среды). При проведении бактериологического исследования используют в комплексе методы серологической и биохимической типизации.
Из паренхиматозных органов (печени, почек, селезенки) лимфатических узлов туши или из пораженных участков органа и ткани приготовляют 2-10 мазков-отпечатков (в зависимости от характера патологических изменений и предполагаемого диагноза).
Препараты высушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают одновременно и по Граму и 2%-ным раствором сафранина или раствором Ребигера.
При бактериоскопии мазков прежде всего обращают внимание на наличие возбудителя сибирской язвы.
При окраске сафранином сибиреязвенные бациллы окрашиваются в кирпично-красный цвет, а капсулы, тени (следы распада бактерий) – в светло-желтый.
При окраске раствором Ребигера сибиреязвенные бациллы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а капсулы – в красно-фиолетовый.
В мазках из лимфатических узлов или других тканей свиней, крупного рогатого скота при очаговом поражении, наряду с типичными капсульными палочками, могут обнаруживаться атипичные бациллы сибирской язвы в виде сильно изогнутых или перекрученных длинных нитей, разбухших и потерявших правильные контуры, или распавшихся на отдельные, как бы осколки бацилл или теней различной величины, отрицательно окрашивающихся по Граму или в виде конгломерата капсул, наполненных мельчайшими включениями.
Наличие в мазках грамположительных палочек с обрубленными концами, а при окраске сафранином или раствором Регибера – палочек или цепочек с капсулами или теней в мазках из лимфатических узлов свиней со специфической для сибирской язвы патологической картиной, дает предварительное заключение об обнаружении (бактериоскопически) микробов, характерных для возбудителя сибирской язвы.
При наличии в мазках атипичных бацилл одновременно с бактериоскопией ставят реакцию преципитации.
В зависимости от результатов бактериоскопии и характера роста на питательных средах проводят исследования на наличие определенных микробов.
ИССЛЕДОВАНИЕ НА НАЛИЧИЕ ВАС. ANTHRACIS
Взятие материала производится врачом-бактериологом немедленно после извещения. При соблюдении всех мер предосторожности материал доставляют в лабораторию. Для исследования берут отечные части туш, лимфатические узлы, паренхиматозные органы и трубчатую кость. От павших и невскрытых животных берут ухо, место разреза прижигают. В лаборатории из всех подозрительных проб делают 5—10 мазков, подсушивают, фиксируют и окрашивают по Граму, фуксином, синью, по Романовскому.
Для бактериологического исследования производят посев из подозрительного материала на мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар. Посевы выращивают при 37°. Если материал сильно загрязнен, то делают посев в две пробирки с бульоном и одну из них прогревают на водяной бане при 80° в течение 20 минут.
ИССЛЕДОВАНИЕ НА НАЛИЧИЕ CL. BOTULINUM
Стерильно взятые кусочки мясопродуктов (мышцы, печень, мозг) засевают в две пробирки со средой Китта—Тароцци, предварительно прогретые на водяной бане 15—20 минут для удаления воздуха и быстро охлажденные в воде. Одну из засеянных пробирок прогревают при 80° в течение 20 минут. Выращивают до 5 суток при 37°. Присутствие грамположительных ракеткообразных палочек в случае пророста среды дает право производить дальнейшее исследование и ставить биологическую пробу (см. часть III, стр. 351).
Для анализа отдельно отбирают по 5 г наружной и внутренней части изделия и из каждой готовой 10% суспензию (разведение 1 : 10), для чего к 5 г, помещенным в стерильную ступку, постепенно приливают 45 мл стерильного физраствора.
Для определения общей обсемененности производят дополнительное разведение 1 : 100 (10% взвесь разводят в 10 раз) и 1 мл этого разведения заливают МПА в стерильных чашках Петри. Посевы инкубируют 48 г при 37°С. Расчет производят как обычно на 1 г исследуемого продукта.
ГОСТ 4288—76 предусматривает лишь определение наличия микробов группы кишечной палочки в 0,5 г изделия.
Порядок анализа: 5 мл 10% взвеси продукта засевают в 5 мл питательной среды и инкубируют посевы 24 часа при температуре 37°С. В случае роста кишечных палочек на среде Хейфеца, происходит ферментация манита, среда приобретает желтый цвет. Для окончательного заключения о наличии бактерий группы кишечной палочки в изделии делают высев с жидких сред на чашки со средой Эндо. При наличии на чашках после 24-часовой инкубации при 37°С подозрительных колоний изготовляют мазки и окрашивают их по Граму.
Наличие в посевах Гр
неспоровых бактерий, образующих характерные для группы кишечных палочек колонии, указывает на загрязненность изделия кишечными палочками, имеющими санитарно-показательное значение.
Методы бактериологического исследования колбасных изделий и продуктов из мяса изложены в ГОСТе 9958—74.
При ветсаноценке мяса и мясопродуктов, в зависимости от результатов исследования, надо руководствоваться следующими правилами:
1) при обнаружении кишечной палочки только во внутренних органах и отсутствии ее в мясе и лимфатических узлах все органы бракуют, а тушу выпускаю без ограничения;
2) при обнаружении кишечной палочки не только во внутренних органах, но и в мясе или лимфатических узлах органы бракуют, а тушу можно использовать в пищу после проварки;
3)при обнаружении S.s. enteretidis, t. murium только во внутренних органах все внутренние органы бракуют, а тушу подвергают проварке в открытых котлах кусками толщиной 8 см. в течение 2 1/2 час. или стерилизации при 1,3 атм. 2 часа;
4) при обнаружении же указанных сальмонелл в мясных пробах или лимфатических узлах вся туша с органами подлежит технической утилизации или уничтожению;
5) при обнаружении cholerae suis Kunz. или других сальмонелл не только в органах, но даже и в мясе органы бракуют, а тушу обезвреживают высокой температурой кусками толщиной 8 см при режиме, указанном в п. 3;
6) при обнаружении в мясе большого количества микробов гнилостной группы, но при нормальных данных органолептического исследования мясо считается условно годным и подлежит обработке высокой температурой (см. п. 3); при неблагоприятных же результатах органолептического исследования такое мясо в пищу не может быть допущено;
7)при обнаружении в готовых мясопродуктах возбудителей пищевых токсикоинфекций, мясопродукты подлежат утилизации или уничтожению;
8)готовые мясопродукты подлежат уничтожению и при обнаружении в них гнилостных микробов при одновременной неудовлетворительной органолептической оценке. Если же последняя удовлетворительна, то мясопродукты могут быть переработаны в низкие сорта мясных изделий со вторичной проверкой.
При выделении из мяса возбудителей анаэробных инфекций и сибирской язвы, тушу, внутренние органы и другие продукты убоя, а также все обезличенные продукты убоя, полученные от убоя другого скота и смешанные с продуктами от больных животных, уничтожают ( сжигают).
Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.
Методика отбора проб мяса для бактериологического исследования
Методы бактериологического анализа
Meat. Methods of bacteriological analysis
Дата введения 1977-01-01
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Государственным агропромышленным комитетом СССР
В.М.Горбатов, В.Г.Дедаш, Е.М.Фрейдлин
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 14.11.75 N 3054
3. ВЗАМЕН ГОСТ 7269-54 в части раздела II
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Обозначение НТД, на который дана ссылка
5. Ограничение срока действия снято по протоколу N 4-93 Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 4-94)
6. ПЕРЕИЗДАНИЕ (март 1999 г.) с Изменениями N 1, 2, утвержденными в октябре 1981 г., январе 1987 г. (ИУС 1-82, 4-87)
Настоящий стандарт распространяется на мясо и субпродукты от всех видов убойного скота и устанавливает методы бактериологического исследования для выявления в них аэробных бактерий (бацилл сибирской язвы, бактерий из рода сальмонелл, бактерий из рода кишечной палочки-Эшерихий, бактерий из рода протея, бактерий рожи свиней, бактерий листериоза, бактерий пастереллеза, бактерий из группы кокков) и анаэробных бактерий (патогенных и токсигенных клостридий).
Бактериологическое исследование мяса и субпродуктов производят во всех случаях, предусмотренных действующей нормативно-технической документацией, правилами ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов и другими нормативными актами, а также по требованию органов, осуществляющих ветеринарный или санитарный надзор.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
1. МЕТОДЫ ОТБОРА ОБРАЗЦОВ
1.1. В зависимости от характера заболевания на бактериологическое исследование направляют от туши:
— часть мышцы сгибателя или разгибателя передней и задней конечностей туши длиной не менее 8 см или кусок другой мышцы размером не менее 8x6x6 см;
— долю печени с печеночным лимфатическим узлом или желчным пузырем, освобожденным от желчи, почку и селезенку.
Для бактериологического исследования на листериоз направляют: головной мозг, долю печени и почку.
Для бактериологического исследования на возбудителя сибирской язвы направляют лимфатический узел пораженного органа или лимфатический узел, собирающий лимфу с места локализации подозрительного фокуса, отечную ткань, ухо, а у свиней, кроме того, подчелюстной лимфатический узел.
При исследовании полутуш или четвертин туш берут кусок мышцы, лимфатические узлы и трубчатую кость.
При исследовании соленого мяса, находящегося в бочечной таре, берут образцы мяса и имеющиеся лимфатические узлы сверху, из середины и со дна бочки, а также, при наличии, трубчатую кость и рассол.
Примечание. Если берут часть печени, почки, селезенки, то поверхность разреза прижигают.
1.2. Образцы завертывают каждый в отдельности в полиэтиленовую пленку по ГОСТ 10354 или пергамент по ГОСТ 1341, помещают в бумажный пакет, на котором ставят дату отбора образца, номер туши и направляют в лабораторию в общей таре (ящике).
1.3. При необходимости пересылки образцов в лабораторию, расположенную за пределами предприятия или хозяйства, где отбирают образцы, тару с образцами опечатывают или пломбируют.
В сопроводительном документе указывают:
— наименование продукта с указанием вида мяса, от которого взят образец, и его количество;
ГОСТ 21237-75 Мясо. Методы бактериологического анализа
Текст ГОСТ 21237-75 Мясо. Методы бактериологического анализа
ГОСТ 21237-75
МЕТОДЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
Методы бактериологического анализа
Methods of bacteriological analysis
МКС 07.100.30 67.120.10 ОКСТУ 9209
Дата введения 01.01.77
Настоящий стандарт распространяется на мясо и субпродукты от всех видов убойного скота и устанавливает методы бактериологического исследования для выявления в них аэробных бактерий (бацилл сибирской язвы, бактерий из рода сальмонелл, бактерий из рода кишечной палочки-Эшери-хий, бактерий из рода протея, бактерий рожи свиней, бактерий листериоза, бактерий пастереллеза, бактерий из группы кокков) и анаэробных бактерий (патогенных и токсигенных клостридий).
Бактериологическое исследование мяса и субпродуктов производят во всех случаях, предусмотренных действующей нормативно-технической документацией, правилами ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов и другими нормативными актами, а также по требованию органов, осуществляющих ветеринарный или санитарный надзор.
(Измененная редакция, Изм. № 2).
1. МЕТОДЫ ОТБОРА ОБРАЗЦОВ
1.1. В зависимости от характера заболевания на бактериологическое исследование направляют от
— часть мышцы сгибателя или разгибателя передней и задней конечностей туши длиной не менее 8 см или кусок другой мышцы размером не менее 8-6-6 см;
— лимфатические узлы — поверхностный шейный или собственно подкрыльцовый и наружный подвздошный вместе с окружающей их соединительной и жировой тканью, а от свиней — поверхностный шейный дорзальный (при отсутствии патологических изменений в области головы и шеи) или подкрыльцовый первого ребра и надколенный;
— долю печени с печеночным лимфатическим узлом или желчным пузырем, освобожденным от желчи, почку и селезенку.
Для бактериологического исследования на листериоз направляют: головной мозг, долю печени и почку.
Для бактериологического исследования на возбудителя сибирской язвы направляют лимфатический узел пораженного органа или лимфатический узел, собирающий лимфу с места локализации подозрительного фокуса, отечную ткань, ухо, а у свиней, кроме того, подчелюстной лимфатический узел.
При исследовании полутуш или четвертин туш берут кусок мышцы, лимфатические узлы и трубчатую кость.
При исследовании соленого мяса, находящегося в бочечной таре, берут образцы мяса и имеющиеся лимфатические узлы сверху, из середины и со дна бочки, а также, при наличии, трубчатую кость и рассол.
Примечание. Если берут часть печени, почки, селезенки, то поверхность разреза прижигают.
1.2. Образцы завертывают каждый в отдельности в полиэтиленовую пленку по ГОСТ 10354 или пергамент по ГОСТ 1341, помещают в бумажный пакет, на котором ставят дату отбора образца, номер туши и направляют в лабораторию в общей таре (ящике). * ★
1.3. При необходимости пересылки образцов в лабораторию, расположенную за пределами предприятия или хозяйства, где отбирают образцы, тару с образцами опечатывают или пломбируют.
В сопроводительном документе указывают:
— наименование продукта с указанием вида мяса, от которого взят образец, и его количество;
— наименование предприятия или хозяйства, где отобран образец, и его адрес;
— причину направления образцов на исследование;
— краткие патологоанатомические данные и предполагаемый диагноз;
— дату взятия образцов и подпись лица, направившего их на исследование.
2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
2.1. Для проведения бактериологического исследования применяют:
баню водяную с терморегулятором;
весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104;
гомогенизатор бактериологический или аппарат для измельчения тканей с числом оборотов не менее 8000 об/мин и не более 45000 об/мин; горелки газовые; дистиллятор;
котлы с паровой рубашкой; компаратор;
лупу с увеличением 3—5 по ГОСТ 25706;
микроскоп типа МБИ или МБР или других аналогичных марок;
мясорубку бытовую по ГОСТ 4025;
ножницы медицинские по ГОСТ 21239; осветитель ОИ-19;
пинцеты медицинские по ГОСТ 21241; потенциометр или рН-метр;
спиртовки стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336; термостат электрический с автоматическим регулятором; ультратермостат;
флаконы Сокслета (бутылки для детского питания); холодильник электрический бытовой по ГОСТ 16317; часы песочные по ОСТ 25—11—38 на 1, 2, 5 и 15 мин; шкаф сушильный электрический лабораторный; бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026; бутылки стеклянные;
вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556; воду бромную;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709; воду питьевую по ГОСТ 2874*;
воронки стеклянные по ГОСТ 25336, конусообразные, вместимостью 250, 500 см 3 ; дрожжи прессованные по ГОСТ 171;
желчь крупного рогатого скота свежую или сухую обезвоженную; кастрюли;
колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336; кровь крупного рогатого скота, овец, лошадей; марлю медицинскую по ГОСТ 9412; масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164; масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739; *
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51232—98.
мел химически осажденный по ГОСТ 6253; мясо-говядину по ГОСТ 779; панкреатин пищевой сухой; пенициллин;
пептон венгерской фирмы «Рихтер»;
пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805; пептон чешской фирмы «Спофа»; петледержатели; печень говяжью;
пипетки вместимостью 1, 2 см 3 с ценой деления 0,05 и 0,1 см 3 и вместимостью 10 см 3 ;
плазму цитратную кроличью сухую;
железу поджелудочную крупного рогатого скота;
поплавки для пробирок и колб длиной 20, 45 и 75 мм, диаметром соответственно 2, 5 и 10 мм; посуду мерную стеклянную по ГОСТ 1770;
набор агглютинирующих адсорбированных сальмонеллезных сывороток: поливалентной О-сыво-ротки групп А, В, С, Du Ей моновалентных О- и Н-сывороток; пробирки стеклянные бактериологические по ГОСТ 25336; пробки корковые по ГОСТ 5541; пробки резиновые;
проволоку из никелевых сплавов диаметром 0,3—0,5 мм по ГОСТ 1791;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962* или спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300;
стекла покровные по ГОСТ 6672;
стекла предметные по ГОСТ 9284;
ступки фарфоровые с пестиками по ГОСТ 9147;
хлороформ технический по ГОСТ 20015;
цилиндры вместимостью 100, 250, 500 см 3 по ГОСТ 1770;
чашки с крышками стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336 (чашки Петри);
штативы для пробирок;
генциан фиолетовый (генцианвиолет);
глицерин по ГОСТ 6259, х.ч.;
Д-глюкозу по ГОСТ 6038, Д (+), х.ч.; желатин по ГОСТ 11293; йод металлический по ГОСТ 4159, х.ч.; калий йодистый по ГОСТ 4232, х.ч.;
калий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 2493, х.ч.; калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, х.ч.; кислоту карболовую кристаллическую; кислоту фосфорную по ГОСТ 6552; кристаллический фиолетовый (кристаллвиолет); лактозу, х.ч.;
магний сернокислый по ГОСТ 4523, х.ч.; магний хлористый по ГОСТ 4209, х.ч.; маннит (маннитол) по ТУ 6—09—5484, х.ч., Д (—); синь метиленовую;
метиловый красный по ТУ 6—09—5169; метиловый фиолетовый медицинский (метилвиолет); мочевину по ГОСТ 6691, х.ч.;
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652—2000.
набор углеводов для исследования ферментации микробов кишечной группы (большой);
натрий-аммоний фосфорнокислый по ГОСТ 4170;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
натрий двууглекислый по ГОСТ 4201, х.ч.;
натрий кислый селенистокислый (без теллура);
натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280;
натрий сернистокислый (сульфит натрия) безводный по ГОСТ 195, х.ч.; тиосульфат натрия по ГОСТ 27068, х.ч.;
натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный по ГОСТ 11773, х.ч.;
натрий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 245, х.ч.;
натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.;
сахарозу по ГОСТ 5833, х.ч.; свинец уксуснокислый по ГОСТ 1027;
соль закиси железа и аммония двойную сернокислую (соль Мора) по ГОСТ 4208; фенол;
феноловый красный по ТУ 6—09—5170, х.ч.; фуксин кислый для микробиологических целей; фуксин основной для микробиологических целей; агар микробиологический по ГОСТ 17206; агар сухой питательный; агар Плоскирева сухой бактериологический; агар сухой висмут-сульфит;
агар сухой с эозин-метиленовым синим (среда Левина);
воду мясную по ГОСТ 20729;
бульон мясо-пептонный по ГОСТ 20730;
диализат или экстракт дрожжевой;
сальмонеллезный О-бактериофаг; сибиреязвенный фаг «гамма МВ А».
(Измененная редакция, Изм. № 1, 2).
3. ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЮ
3.1. Приготовление питательных сред, реактивов, красок
3.1.1. Приготовление м я с о-п е п т о н н о г о агара
К 1000 см 3 мясо-пептонного бульона перед стерилизацией добавляют 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения.
Мясо-пептонный агар, охлажденный до температуры 50—55 °С, осветляют яичным белком (из расчета один белок на 1000 см 3 мясо-пептонного агара), помещают в автоклав, не завинчивая крышку автоклава, или в аппарат Коха на 1 ч, чтобы белок свернулся и, оседая, увлек за собой взвешенные частицы. Горячий мясо-пептонный агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают в нем pH 7,0-7,4, разливают во флаконы или пробирки и 20 мин стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С.
3.1.2. Приготовление основного раствора Хоттингера
1000 г мяса, освобожденного от жира и сухожилий, нарезают кусками размером 1—2 см и опускают небольшими порциями в кастрюлю с двойным количеством кипящей водопроводной воды. Кипятят в течение 15—20 мин, пока цвет мяса не станет серым; это указывает на то, что белки свернулись. Мясо вынимают шумовкой и измельчают на мясорубке. Оставшуюся жидкость фильтруют и в ней устанавливают pH 8,0. Фарш опускают в отфильтрованную жидкость и охлаждают до температуры 40 °С в открытой кастрюле, затем добавляют очищенную от жира, соединительной ткани и дважды измельченную поджелудочную железу в количестве 10 % к полученной взвеси (на 1000 см 3 жидкости 100 г железы) или сухой панкреатин в количестве 0,5—1,0 % (в зависимости от его активности). Полученную смесь хорошо размешивают, после чего снова подщелачивают 10 %-ным раствором гидроокиси натрия до pH 7,8—8,0 и повторяют такое же подщелачивание через 30 мин. Отсутствие сдвига реакции смеси указывают на его доброкачественность.
После установления pH смесь переливают в бутыль с хорошо подобранной резиновой пробкой с таким расчетом, чтобы у часть бутылки оставалась свободной. Затем добавляют в количестве 1—3 % от объема хлороформа (в холодное время года — меньше, чем в теплое), закрывают бутыль пробкой и несколько раз встряхивают, после чего вынимают пробку для удаления избытка хлороформа и тут же снова закрывают.
Через 1—2 ч после добавления поджелудочной железы или панкреатина проверяют реакцию, устанавливают pH 7,4—7,6 и оставляют смесь для переваривания на 7—16 суток при комнатной температуре до образования аморфного осадка.
Первые 3—4 суток переваривания ежедневно проверяют реакцию среды и поддерживают pH на уровне 7,4—7,6. В течение этого времени встряхивают жидкость не менее трех раз в сутки так же, как указано выше. В дальнейшем встряхивать можно реже.
За 1—2 суток до окончания переваривания встряхивание прекращают, чтобы гидролизат отстоялся. Конец переваривания характеризуется следующими признаками: на дне бутылки собирается аморфный осадок; жидкость над осадком просветляется и принимает соломенно-желтый цвет; гидролизат легко фильтруется; реакция на триптофан с бромной водой должна быть положительной (в пробирку наливают 3—4 см 3 фильтрованного гидролизата, добавляют три-четыре капли бромной воды); при наличии триптофана жидкость принимает розово-фиолетовый цвет, в то время как контрольная пробирка с гидролизатом без бромной воды имеет желтое окрашивание. 5 %-ный гидролизат должен содержать 1,1—1,2 % общего азота. После гидролиза жидкость фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, сливают в бутыль и стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120 °С.
Приготовленную среду можно хранить пять месяцев. Перед употреблением жидкость фильтруют.
(Измененная редакция, Изм. № 2).
3.1.3. Приготовление бульона Хоттингера
К 100 см 3 основного раствора добавляют 500 см 3 водопроводной воды, 3 г хлористого натрия и 0,12 г двузамещенного фосфорнокислого калия. Полученный раствор кипятят в течение 10 мин, фильтруют, устанавливают pH 7,2—7,4 и стерилизуют в течение 20 мин при температуре 120 °С.
3.1.4. Приготовление физиологического раствора
В 1000 см 3 дистиллированной воды растворяют 8,5 г химически чистого хлористого натрия. Раствор доводят до кипения, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы или пробирки и стерилизуют 20 мин в автоклаве при температуре 120 °С.
3.1.5. Приготовление среды Левина
К 100 см 3 расплавленного мясо-пептонного агара с pH 7,0—7,4, приготовленного по п. 3.1.1, добавляют 2 см 3 0,5 %-ного водного раствора предварительно подогретой на водяной бане метиленовой сини, 1,5 см 3 2 %-ного раствора эозина (бактериологического), 2 г лактозы и 0,2 г двузамещенного фосфорнокислого калия. Растворы красок готовят на дистиллированной воде и стерилизуют 1 ч при температуре 100 °С. После добавления всех компонентов в указанном порядке среду тщательно перемешивают, разливают в чашки и подсушивают. Среда должна иметь красно-фиолетовый цвет.
Среда Левина может быть приготовлена из сухой стандартной среды по прописи, указанной на этикетке.
3.1.6. Среды фуксин-сульфитный агар (среда Эндо), бактоагар Плоскирева, висмут-сульфит агар (среда Вильсон-Блера) могут быть приготовлены из сухих стандартных сред по прописи, указанной на этикетке.
3.1.7. Приготовление среды Мюллера
Для приготовления среды Мюллера вначале готовят растворы серноватистокислого натрия и Люголя.
В мерный цилиндр с 50 г серноватистокислого натрия добавляют до 100 см 3 дистиллированной воды. Раствор переливают в бутыль и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин.
Для приготовления раствора Люголя в 100 см 3 дистиллированной воды растворяют 25 г металлического йода, 20 г йодистого калия.
Для приготовления среды Мюллера в стерильные флаконы помещают по 4,5 г мела и стерилизуют их сухим паром в течение 1 ч. Затем наливают в каждый флакон по 90 см 3 бульона из перевара Хоттингера, содержащего 0,13—0,15 % аминного азота, устанавливают pH 7,2—7,4 и стерилизуют при температуре 120 °С. После стерилизации вновь устанавливают pH 7,2—7,4, для чего проверяют в одном из флаконов и определяют необходимый для подтитровки данного количества среды объем соляной кислоты или гидроокиси натрия. Затем в асептических условиях перед употреблением добавляют по 2 см 3 раствора Люголя и по 10 см 3 раствора серноватистокислого натрия.
(Измененная редакция, Изм. № 2).
3.1.8. Приготовление среды Кауфмана
К 500 см 3 стерильной среды Мюллера, приготовленной по п. 3.1.7, добавляют 25 см 3 стерильной желчи крупного рогатого скота и 5 см 3 0,1 %-ного водного раствора бриллиантовой зелени. Смесь хорошо взбалтывают, разливают в стерильные флаконы, но не стерилизуют.
3.1.9. Приготовление селенитового Ф-б у л ь о н а
Среду готовят из двух основных растворов — А и Б.
Раствор А состоит из 5 г пептона чешской фирмы «Спофа» или венгерской фирмы «Рихтер», 7 г безводного двузамещенного фосфорнокислого натрия, 3 г однозамещенного фосфорнокислого натрия, 4 г х.ч. лактозы, 100 см 3 дистиллированной воды, pH раствора 6,9—7,1. Раствор стерилизуют 30 мин при температуре 112 °С.
Раствор Б состоит из 10 %-ного раствора кислого селенистокислого натрия, приготовленного на стерильной воде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.
При изменении серии любого из входящих в среду компонентов (пептона, кислого селенисто-кислого натрия, фосфатов) проводят предварительно подтитровку, для чего экспериментально определяют точную пропорцию фосфорнокислого двузамещенного безводного натрия и фосфорнокислого однозамещенного натрия, которая с используемыми образцами пептона и селенистокислого натрия дает pH не выше 6,9—7,1, что регулируется изменением соотношения фосфатов.
Для приготовления селенитовой среды к 50 см 3 раствора А стерильно добавляют 2 см 3 раствора Б. Среду разливают в стерильные флаконы или колбы, но не стерилизуют.
3.1.10. Приготовление хлористомагниевой среды «М» (модифицированной)
Среду готовят из трех основных растворов А, Б и В.
Для приготовления раствора А в 90 см 3 дистиллированной воды растворяют 0,42 г сухого ферментативного пептона, 0,7 г хлористого натрия, 0,15 г однозамещенного фосфорнокислого калия, 4 см 3 дрожжевого диализата.
Для приготовления раствора Б в 9 см 3 дистиллированной воды растворяют 3,6 г кристаллического хлористого магния.
Раствор В состоит из 0,09 см 3 5 %-ного водного раствора бриллиантовой зелени.
Для приготовления хлористомагниевой среды «М» (модифицированной) растворы А, Б и В смешивают и стерилизуют 30 мин при температуре 112,5 °С.
Концентрированную среду готовят, удваивая содержание всех компонентов, кроме дистиллированной воды.
При отсутствии дрожжевого диализата допускается применять дрожжевой экстракт.
3.1.11. Приготовление дрожжевого экстракта
В 2000 см 3 дистиллированной воды растворяют 1000 г прессованных хлебопекарных дрожжей. Полученную суспензию стерилизуют 30 мин текучим паром, затем отстаивают в холодильнике при температуре 4 °С в течение 5—6 суток.
Жидкость над осадком декантируют, приливают 2,5 см 3 0,01 %-ного раствора кристаллического фиолетового, разливают во флаконы или пробирки и вновь стерилизуют при температуре 100 °С в течение 30 мин. Экстракт хранят в холодильнике при температуре 4—6 °С до двух недель.
3.1.12. Приготовление среды Киллиана
К 100 см 3 стерильного питательного бульона (pH 6,8—6,9) стерильно добавляют 1 см 3 0,1 %-ного раствора бриллиантовой зелени. Раствор бриллиантовой зелени готовят следующим образом: 0,1 г бриллиантовой зелени заливают 100 см 3 дистиллированной воды, помещают во флаконы с резиновой или корковой пробкой и помещают в термостат при температуре 37 °С на сутки.
3.1.13. Приготовление т р е х с а х а р н о г о агара с мочевиной (К р у м в и д е-0 лькеницкого в модификации Ковальчука)
В 1000 см 3 дистиллированной воды растворяют 2 г глюкозы, 3,5 г сахарозы, 15 г лактозы, 0,6 г соли Мора, 1 г серноватистокислого натрия и 10 г мочевины. Соль Мора и серноватистокислый натрий предварительно растворяют в 5—7 см 3 дистиллированной воды в пробирках. Углеводы и мочевину также растворяют в 10 см 3 дистиллированной воды в колбе на водяной бане. До стерилизации устанавливают pH 7,4—7,6 и добавляют 46 г сухой среды с сахарозой и индикатором «ВР». Раствор размешивают и кипятят до расплавления агара, разливают в пробирки по 5—6 см 3 в каждую. Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют текучим паром 2 дня по 30 мин или при температуре 112 °С в течение 20 мин. После стерилизации среду скашивают так, чтобы остался небольшой столбик (не менее 3 см).
3.1.14. Приготовление и е и т о и и о-у г л е в о д и ы х сред (среды Гисса)
К 100 см 3 дистиллированной воды прибавляют 1 г сухого ферментативного пептона, 0,5 г хлористого натрия и нагревают до растворения, затем фильтруют до тех пор, пока раствор не станет совершенно прозрачным. Устанавливают pH 0,7, прибавляют 0,5 г углевода и 1 см 3 индикатора Андреде.
Среду разливают по 5 см 3 в пробирки с поплавками и стерилизуют 20 мин при температуре 110 °С. Среда должна быть бесцветной или соломенно-желтого цвета, без розового оттенка. Можно использовать готовые среды Гисса.
Для приготовления индикатора Андреде к 100 см 3 дистиллированной воды добавляют 16,4 см 3 1 моль/дм 3 раствора гидроокиси натрия и 0,5 г кислого фуксина. Раствор стерилизуют 5 мин при температуре 110—112 °С. Индикатор хранят в склянке из темного стекла.
(Измененная редакция, Изм. № 2).
3.1.15. Приготовление пептонной воды
К 1000 см 3 дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 5 г хлористого натрия, кипятят до растворения пептона, фильтруют и устанавливают pH 7,2—7,4, после чего стерилизуют 30 мин при температуре 120 °С.
3.1.16. Приготовление плазмы крови
В пробирку вносят 2 см 3 5 %-ного раствора лимоннокислого натрия и 8 см 3 только что полученной крови кролика. Цитратную кровь ставят на 18—20 ч в холодильник при температуре 4—6 °С или подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 15 мин. В результате чего над осадком эритроцитов образуется прозрачный слой жидкости желтоватого цвета — плазмы, которую разводят физиологическим раствором 1:4.
3.1.17. Приготовление дефибринированной крови
В колбу со стеклянными бусами сливают 8 см 3 только что взятой крови кролика, барана, лошади и непрерывно встряхивают в течение 10—15 мин, в результате чего находящийся в крови фибрин выпадает в осадок, обволакивает бусы. Дефибринированную кровь сливают в другую колбу или пробирку. Слитая дефибринированная кровь утрачивает способность свертываться.
3.1.18. Приготовление кровяного агара
К 100 см 3 расплавленного стерильного мясо-пептонного агара, приготовленного по и. 3.1.1 и охлажденного до температуры 45 °С, стерильно прибавляют 5—10 см 3 стерильно взятой дефибринированной крови. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри, дают ей застыть и подсушивают в термостате при температуре 37 °С. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет.
3.1.19. Приготовление агара Симмонса
В 1000 см 3 дистиллированной воды растворяют 5 г хлористого натрия, 0,2 г сернокислого магния, 1,5 г фосфорнокислого натрия-аммония, 2 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 5 г нейтрального лимоннокислого натрия, 20 г агара. Раствор фильтруют, добавляют 40 см 3 раствора бромтимолового синего (1:500). Среду разливают в пробирки по 5—6 см 3 в каждую, стерилизуют при температуре 120 °С в течение 20 мин, после чего скашивают. Готовая среда должна быть оливкового цвета.
3.1.20. Приготовление среды Государственного контрольного института (ГКИ)
В стерильную колбу наливают 60 см 3 раствора Хенкса и добавляют стерильно 40 см 3 сыворотки крови крупного рогатого скота, прогретой при температуре 56 °С в течение 30 мин. После тщательного перемешивания устанавливают pH 7,2 раствором двууглекислого натрия и разливают среду по 2 см 3 в стерильные пробирки, которые закрывают стерильными резиновыми пробками. Среду можно хранить при температуре 4 °С до четырех месяцев.
3.1.21. Приготовление среды Дрожжевкиной
К 10 см 3 стерильного желтка куриного яйца добавляют 90 см 3 физиологического раствора, тщательно перемешивают. Смесь разливают по 8 см 3 в стерильные пробирки. Перед употреблением проверяют стерильность среды, поместив ее в термостат при температуре 37 °С на 48 ч.
3.1.22. Приготовление среды Кит т-Т а р о ц ц и
Свежую печень крупного рогатого скота разрезают на куски массой по 50—60 г, заливают равным количеством воды и кипятят в течение 30 мин при постоянном помешивании. Печеночный экстракт фильтруют через ватно-марлевый фильтр и смешивают с мясо-пептонным бульоном из расчета одна часть печеночного экстракта на три части бульона. Смесь нагревают до кипения, добавляют хлористый натрий из расчета 1,25 г на 1000 см 3 среды и устанавливают pH 7,6—7,8, после чего кипятят в течение 15 мин и фильтруют через бумажный фильтр.
В пробирки кладут мелко нарезанные кусочки печени по 1,5—2 г и заливают смесью печеночного экстракта с мясо-пептонным бульоном. На поверхность среды наслаивают 0,5—1 см 3 вазелинового масла. Среду стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120 °С.
3.1.23. Разведение пенициллина
В пять пробирок наливают по 4,5 см 3 в каждую стерильной дистиллированной воды. В первую пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 см 3 пенициллина основного разведения и получают в первой пробирке разведение, содержащее 10 тыс. ед. пенициллина в 1 см 3 раствора. Новой пипеткой из первой пробирки, тщательно перемешав содержимое, переносят 0,5 см 3 раствора во вторую пробирку и получают разведение, содержащее 1000 ед. пенициллина в 1 см 3 раствора. Таким же образом из второй пробирки переносят в третью 0,5 см 3 и получают разведение, содержащее 100 ед. пенициллина в 1 см 3 раствора. Из третьей пробирки переносят 0,5 см 3 в четвертую и получают разведение, содержащее 10 ед. в 1 см 3 раствора. Из четвертой пробирки переносят 0,5 см 3 в пятую и получают в пятой пробирке разведение, содержащее 1 ед. пенициллина в 1 см 3 раствора.
3.1.24. Приготовление м я с о-п е и т о и и о г о агара с пенициллином
В три колбочки или большие пробирки, содержащие по 20 см 3 стерильного расплавленного и
3.1.25. Приготовление индикаторной бумаги для определения индола
5 г парадиметиламидобензальдегида, 10 см 3 очищенной концентрированной фосфорной кислоты растворяют в 50 см 3 96 ° спирта. В тепловатом растворе смачивают фильтровальную бумагу, высушивают, нарезают узкими полосками. Цвет бумаги — желтый. При наличии индола цвет бумаги меняется от сиреневато-розового до интенсивно малинового. Появление других цветов на индикаторной бумаге не учитывают.
3.1.26. Приготовление индикаторной бумаги для определения сероводорода
В 100 см 3 дистиллированной воды растворяют 20 г уксуснокислого свинца и 1 г двууглекислого натрия. Этим раствором пропитывают полоски фильтровальной бумаги, высушивают их при температуре 18—23 °С и нарезают на узкие полоски. После приготовления бумага остается белой: при наличии сероводорода чернеет.
3.1.27. Приготовление насыщенного спиртового раствора метиленовой сини
В 100 см 3 96 ° этилового спирта растворяют 8—9 г метиленовой сини. Раствор фильтруют.
3.1.28. П р и г о т о в л е н и е водно-спиртового раствора метиленовой сини
К 30 см 3 дистиллированной воды добавляют 1 см 3 насыщенного спиртового раствора метиленовой сини, приготовленной по и. 3.1.27.
3.1.29. Приготовление метиленовой сини Леффлера
К 100 см 3 дистиллированной воды добавляют 30 см 3 насыщенного спиртового раствора метиленовой сини и 1 см 3 1 %-ного раствора гидроокиси калия.
3.1.30. Приготовление насыщенного спиртового раствора фуксина
8—9 г основного кристаллического фуксина высыпают во флакон, заливают 100 см 3 96 ° этилового спирта и ставят на 18—24 ч в термостат с температурой 37 °С. Флакон периодически взбалтывают. В течение указанного времени значительная часть краски растворяется, и на дне флакона остается осадок, свидетельствующий о насыщении раствора.
Насыщенный раствор хранят во флаконах из темного стекла. Из насыщенного спиртового раствора готовят водно-спиртовой раствор фуксина. Для этого к 1 см 3 насыщенного раствора добавляют 9 см 3 дистиллированной воды.
3.1.31. Приготовление карболового фуксина Циля
1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты (фенола) и 0,5 см 3 глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см 3 96 ° этилового спирта. После того, как краска полностью разотрется, прибавляют при постоянном помешивании 100 см 3 дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют. Фуксин Циля стойкий и его хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.
3.1.32. Приготовление карболового кристаллического фиолетового, генциа н-ф иолетового или метилового фиолетового для окраски по Граму
1 г кристалл-, генциан- или метилвиолета растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты (фенола). Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см 3 96 ° этилового спирта. После того, как краска полностью растворится, прибавляют при постоянном помешивании 100 см 3 дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через бумажный фильтр. Растворы нестойкие.
3.1.33. Приготовление красящей бумаги по Синеву
В 100 см 3 96 ° этилового спирта растворяют 1 г кристаллвиолета и 1 см 3 глицерина. Краску наливают в лоток. Бумагу нарезают полосками шириной 2,0—2,5 см и длиной 30—50 см. Полоску погружают на несколько секунд в краску так, чтобы она окрасилась с обеих сторон. Окрашенные полоски вынимают пинцетом, дают краске стечь и подвешивают на шпагате для высушивания. Бумагу сушат на воздухе при комнатной температуре 18—23 °С. Высушенные полоски бумаги разрезают на кусочки размером 2-2 см и хранят в банке из темного стекла.
3.1.34. Приготовление раствора Люголя
В 10 см 3 дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия. Затем прибавляют 1 г кристаллического йода. Раствор выдерживают 5—6 ч до полного растворения йода, после чего прибавляют 290 см 3 дистиллированной воды. Хранят раствор в склянке из темного стекла.
3.2. Окраска препаратов
3.2.1. Окраска мазков по Граму (общепринятая модификация)
На фиксированный мазок помещают полоску фильтровальной бумаги и наливают карболовый
генцианвиолет. Выдерживают 1—2 мин, после чего снимают бумажку, сливают краску, мазок промывают водой и наливают на него раствор Люголя (мазок чернеет). Через 1—2 мин раствор сливают и наливают этиловый спирт на 0,5—1 мин. Затем мазок промывают водой и дополнительно окрашивают водным фуксином или водным раствором сафранина в течение 1—2 мин. Затем промывают водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.
Окраску по Граму можно применять в водоизменении Синева, согласно которому вместо карболового генцианвиолета применяют окрашенные полоски фильтровальной бумаги, приготовленной по и. 3.1.33. Для окрашивания мазков на фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной спиртовым раствором кристаллвиолета, и наносят две-три капли воды, которые полностью впитываются бумагой, последняя плотно прилегает к стеклу. Выдерживают 2 мин, затем бумагу удаляют пинцетом и дальнейшую окраску производят по Граму.
3.2.2. Окраска капсул методом Ольта
Мазки окрашивают 2 %-ньгм водным раствором сафранина в течение 1—3 мин (лучше при подогревании) и быстро смывают водой. Раствор сафранина готовят перед употреблением: сафранин растворяют в воде, доведенной до кипения и фильтруют через бумажный фильтр.
3.2.3. Окраска капсул методом Ребигера
Мазки окрашивают и фиксируют одновременно. Готовят раствор: 15—20 г генцианвиолета растворяют в 100 см 3 40 %-ного формалина. Раствор оставляют на 8—10 ч при температуре 20 °С, фильтруют, после чего он готов к употреблению. Окрашивают нефиксированные мазки в течение 15—20 с, быстро промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.
3.3. Подготовка образцов к исследованию и проведению посева
3.3.1. Каждый представленный к исследованию образец (мышцы, лимфатические узлы, паренхиматозные органы) перед посевом освобождают от видимой жировой и соединительной ткани, погружают на 2—3 мин в спирт и два раза обжигают с поверхности. Затем стерильными ножницами из глубины различных мест каждого образца вырезают кусочки размером не менее 2,01,5-2,5 см; лимфатические узлы разрезают пополам. Затем все вырезанные кусочки измельчают стерильными ножницами.
3.3.2. Для посева составляют две пробы по 15 г каждая. Одна проба состоит из кусочков мышц и лимфатических узлов, а вторая — из кусочков паренхиматозных органов (печени, почки и селезенки).
3.3.3. Каждую пробу в отдельности помещают в стерильный стакан (колбу) гомогенизатора для приготовления взвеси. Для этого в стакан (колбу) добавляют по 15 см 3 физиологического раствора, количество которого равно массе каждой пробы, и гомогенизируют пробы в электрическом гомогенизаторе. Вначале измельчают материал замедленной частотой оборотов, затем с большей частотой оборотов не более 2,5 мин (в зависимости от числа оборотов).
1 см 3 приготовленной взвеси содержит 0,5 г продукта.
3.3.4. Полученные взвеси отстаивают 10 мин. Из верхней части надосадочной жидкости пипеткой Пастера или петлей вносят на чашку с мясо-пептонным агаром и элективной средой (Эндо, Левина) одну-две капли или одну петлю и тщательно втирают материал в поверхность предварительно подсушенных сред.
3.3.5. Одновременно с посевом на плотные среды производят посев материала для накопления сальмонелл в одну из сред обогащения (селенитовый Ф-бульон, Мюллера, Кауфмана, Киллиана, хлористомагниевую среду «М»), Для этого 20 см 3 взвеси из мышц и лимфатических узлов вносят в один флакон (колбу), а 20 см 3 взвеси из паренхиматозных органов — в другой. В каждый флакон наливают по 50 см 3 среды обогащения.
При отсутствии гомогенизатора допускается посев кусочка пробы размером не менее 2,01,5-2,5 см (путем нанесения отпечатков разными сторонами пробы на поверхность питательной среды в чашках с предварительно подсушенным мясо-пептонным агаром и элективной средой Эндо, Левина). При этом необходимо произвести также посев на элективные среды из лимфатического узла печени или соскоба с внутренней стенки желчного пузыря. Посев в среду обогащения производят во флаконы Сокслета (колбы), в которые предварительно налито по 50 см 3 среды обогащения (селенитовой Ф-бульон, Мюллера, Кауфмана, Киллиана, хлористомагниевая среда «М»), В один флакон вносится измельченная проба из мышц и лимфатических узлов массой 10 г, а в другой — 10 г из паренхиматозных органов.
Следует иметь в виду, что на селенитовом Ф-бульоне S. typhi suis и S. cholerae suis, как правило, не растут. Наилучший рост S. cholerae suis наблюдается на среде Киллиана.
3.3.6. Посевы помещают в термостат при температуре 37 °С. Через 18 ч чашки с первичными посевами на плотных средах извлекают из термостата и просматривают визуально, при необходимости — через лупу или под малым увеличением микроскопа.
При отсутствии роста через 18 ч посевы выдерживают в термостате дополнительно до 24 ч.
На мясо-пептонном агаре отыскивают колонии, характерные для сибирской язвы, рожи, пасте-реллеза, листериоза, кокковых инфекций и др.
На чашках с элективными средами (Эндо, Левина) отыскивают колонии, характерные для бактерий семейства кишечных.
При обнаружении в мазках микробов, подозрительных на сибирскую язву, посевы на элективную среду и среду обогащения не производят.
4. ПРОВ1ДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Бактериоскопическое исследование
Из паренхиматозных органов (печени, почек, селезенки) лимфатических узлов туши или из пораженных участков органа и ткани приготовляют 2—10 мазков-отпечатков (в зависимости от характера патологических изменений и предполагаемого диагноза).
Препараты высушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают одновременно и по Грамуи 2 %-ным раствором сафранина или раствором Ребигера.
При бактериоскопии мазков прежде всего обращают внимание на наличие возбудителя сибирской язвы.
При окраске сафранином сибиреязвенные бациллы окрашиваются в кирпично-красный цвет, а капсулы, тени (следы распада бактерий) — в светло-желтый.
При окраске раствором Ребигера сибиреязвенные бациллы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а капсулы — в красно-фиолетовый.
В мазках из лимфатических узлов или других тканей свиней, крупного рогатого скота при очаговом поражении, наряду с типичными капсульными палочками, могут обнаруживаться атипичные бациллы сибирской язвы в виде сильно изогнутых или перекрученных длинных нитей, разбухших и потерявших правильные контуры, или распавшихся на отдельные, как бы осколки бацилл или теней различной величины, отрицательно окрашивающихся по Граму или в виде конгломерата капсул, наполненных мельчайшими включениями.
Наличие в мазках грамположительных палочек с обрубленными концами, а при окраске сафранином или раствором Регибера — палочек или цепочек с капсулами или теней в мазках из лимфатических узлов свиней со специфической для сибирской язвы патологической картиной, дает предварительное заключение об обнаружении (бактериоскопически) микробов, характерных для возбудителя сибирской язвы.
При наличии в мазках атипичных бацилл одновременно с бактериоскопией ставят реакцию преципитации.
В зависимости от результатов бактериоскопии и характера роста на питательных средах проводят исследования на наличие определенных микробов.
4.2. Методы выявления аэробных бактерий
4.2.1. Выявление бацилл сибирской язвы
4.2.1.1 Сущность метода выявления бацилл сибирской язвы заключается в определении их характерной морфологии, в определении характера роста на питательных средах и выявлении патогенности путем заражения лабораторных животных.
4.2.1.2. Проведение исследования
Бацилл сибирской язвы обнаруживают в три последовательных этапа: бактериоскопия мазков из патологического материала; получение и изучение свойств чистой культуры на питательных средах; биологическая проба на лабораторных животных и, при необходимости, серологическое исследование.
При бактериоскопии мазков из патологического материала обращают внимание на форму и расположение отдельных микробов и наличие капсул. Характерный вид сибиреязвенных палочек и обилие их в мазке нередко позволяет поставить диагноз уже по результатам бактериоскопического исследования.
Бациллы сибирской язвы на чашках с мясо-пептонным агаром через 16—24 ч растут в виде серобелых шероховатых с бахромчатыми краями колоний, напоминающих под лупой или при малом увеличении микроскопа «головку медузы», «львиную гриву». Из подозрительной колонии делают посев в пробирку с мясо-пептонным бульоном.
На мясо-пептонном бульоне сибиреязвенные бациллы растут в виде крупных хлопьев, оседающих на дно пробирки к концу первых суток, с образованием осадка, напоминающего комок ваты, бульон остается прозрачным.
Из бульонной культуры готовят препарат «раздавленная» или «висячая капля». При микроскопи-ровании препарата обнаруживаются неподвижные сибиреязвенные палочки.
При необходимости дифференциации сибиреязвенных бацилл от сапрофитных бацилл, которые морфологически очень сходны, выделенную чистую культуру на мясо-пептонном агаре или мясо-пептонном бульоне исследуют: на тест «жемчужное ожерелье», чувствительность к сибиреязвенному фагу, свертываемость желтка куриного яйца, гемолитическую активность, капсулообразование.
Тест «жемчужное ожерелье» осуществляют одним из двух способов:
Первый способ. Постановку теста начинают с разведения пенициллина по и. 3.1.23. В три пробирки с мясо-пептонным агаром, в каждой из которых содержится по 0,5 и 0,05 ед. пенициллина в 1 см 3 (по и. 3.1.24), и в контрольную пробирку без пенициллина вносят по 0,25 см 3 трехчасовьгх бульонных культур испытуемых штаммов, выращенных в термостате при температуре 37 °С. Посевы помещают в термостат в наклонном положении (на деревянную рейку или стеклянную трубку) при температуре 37 °С. Через 3 ч из конденсационной жидкости берут бактериологической петлей материал и готовят на предметных стеклах мазки, которые высушивают на воздухе, фиксируют в течение 15 мин спирто-эфирной смесью и окрашивают метиленовой синью, разведенным фуксином или по Граму.
Второй способ. К мясо-пептонному бульону (pH 7,2—7,4) стерильно добавляют 20 % сыворотки крови крупного рогатого скота без консерванта. Для этого берут три пробирки, в каждой из которых содержится по 8 см 3 мясо-пептонного бульона, и добавляют в каждую пробирку 2,0 см 3 сыворотки крови крупного рогатого скота. В первую пробирку добавляют 0,5 см 3 пенициллина, содержащего 10 ед. в 1 см 3 раствора, получают бульон, содержащий в 1 см 3 0,5 ед. пенициллина; во вторую пробирку добавляют 0,5 см 3 пенициллина из пробирки, содержащей 1 ед. пенициллина в 1 см 3 раствора; в третью пробирку пенициллина не добавляют, в ней остается мясо-пептонный бульон с сывороткой крови (контрольная). Бульон с сывороткой крови и пенициллином разливают в стерильные пробирки по 2,5 см 3 и вносят в каждую из них по 0,25 см 3 трехчасовой бульонной культуры, выращенной в термостате при температуре 37 °С, испытуемых штаммов. Для контроля производят посев в бульон с сывороткой крови без пенициллина.
Мясо-пептонный бульон перед посевом нагревают на водяной бане до температуры 40 °С, и засеянные пробирки выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 3—6 ч.
Дальнейший ход исследования проводят в той же последовательности, которая изложена в первом способе.
В случаях отрицательных результатов микроскопии через 3 ч инкубации посевов (на мясо-пептон-ном агаре и мясо-пептонном бульоне) следует продолжить инкубацию до 6 ч и после этого провести заключительный учет теста.
При положительной реакции теста «жемчужное ожерелье» бациллы сибирской язвы образуют цепочки шарообразной формы, которые приобретают сходство с ожерельем из бус. Споровые сапрофитные аэробные бактерии, как правило, не образуют шарообразных форм, а имеют обычную форму палочек, т. е. дают отрицательный результат при постановке этого теста.
Лизис сибиреязвенным фагом «Гамма МВ А» осуществляют одним из двух способов:
Первый способ. На поверхности пластинки с мясо-пептонным агаром (pH 7,2—7,4) в чашке Петри стерильной пробиркой с ровными краями делают 5—6 насечек. Бактериологической петлей или стерильной пастеровской пипеткой с тонко оттянутым концом на поверхность агара в центр насечки (кружка) наносят одну каплю трехчасовой бульонной культуры испытуемых штаммов. Внесенную каплю распределяют равномерно петлей по всей поверхности насечки. Засеянные чашки подсушивают в течение 15—20 мин при температуре 37 °С, после чего в центр каждого посева наносят каплю неразведенного фага, вновь подсушивают в течение 10 мин при температуре 37 °С, и затем чашки помещают в термостат при температуре 37 °С.
Через 6—8 ч в месте посева можно обнаружить стерильное пятно, в контрольных чашках все насечки покрыты культурой, как и в чашках, в которых испытывались сапрофитные спорообразующие аэробные бактерии.
Второй способ — способ «стекающей капли». Исследуемую культуру высевают в три пробирки на скошенный мясо-пептонный агар и выдерживают в термостате при температуре 37 °С не более 20 мин. Пробирки ставят вертикально в штатив. Затем на верхнюю часть агара наносят каплю неразведенного бактериофага. Одну пробирку оставляют для контроля без фага. Действие фага устанавливают через 6— 8 ч. В контрольной пробирке по всей поверхности агара наблюдается обычный рост культуры. В пробирках с фагом по ходу стекания капли микробы не растут, а вокруг этой зоны наблюдается обычный рост культуры в виде «бордюра».
Наиболее четко явление лизиса наблюдается через 16—18 ч.
Свертываемость желтка куриного яйца определяют следующим образом.
Испытуемую культуру высевают в пробирку со средой Дрожжевкиной, приготовленной по п. 3.1.21. Посевы помещают в термостат при температуре 37 °С на время от 8 до 24 ч. За указанное время сибиреязвенная палочка не вызывает коагуляцию желтка куриного яйца, а большинство спорообразующих аэробных бактерий коагулируют желток уже через 6—8 ч.
Гемолитическую активность определяют следующим образом.
Испытываемую культуру высевают на чашку с мясо-пептонным агаром с кровью или в пробирку бульона с кровью. Чашку или пробирку помещают в термостат при температуре 37 °С на 20—24 ч.
При наличии бацилл сибирской язвы на чашке вырастают характерные колонии без гемолиза, бульон с кровью также не гемолизируется. При наличии других сапрофитных спорообразующих бацилл, в большинстве случаев, вокруг колоний образуется зона (1-гемолиза и наступает гемолиз бульона с кровью.
Определение капсулообразования in vitro.
Испытуемую культуру петлей высевают в пробирку со средой «ГКИ», приготовленной по п. 3.1.20, пробирку помещают в термостат при температуре 37 °С. Через 30—120 мин у отдельных сибиреязвенных палочек начинается капсулообразование, а через 16—18 ч все или большинство сибиреязвенных бацилл образуют капсулу. Со среды готовят мазки, фиксируют их 15 мин в метаноле и окрашивают синью Леффлера в течение 15 мин. При микроскопии обнаруживают синие палочки и нити, окруженные розовой капсулой.
Одновременно с бактериоскопией исходного материала в сомнительных случаях производят реакцию преципитации.
Постановка реакции преципитации
2 г материала мелко нарезают в пробирку и заливают 10 см 3 карболизированного 0,5 %-ного физиологического раствора. Если исследуют свежий материал, то его предварительно выдерживают в термостате в течение 18—24 ч при температуре 37 °С. Затем экстракт кипятят в течение 30—40 мин и фильтруют через асбестовую нейтральную вату до полной прозрачности. 0,25—0,3 см 3 прозрачного экстракта вносят в узкую пробирку и под него подслаивают такое же количество преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, профильтрованной через бумажный фильтр.
Реакция считается положительной, если на границе сыворотки и экстракта через 3—8 мин появляется преципитирующее кольцо; сомнительной, если оно появляется через 10—15 мин и отрицательной — при отсутствии кольца.
При проведении реакции преципитации контролем служат: заведомо сибиреязвенный антиген с сибиреязвенной преципитирующей сывороткой, нормальная сыворотка с исследуемым экстрактом и преципитирующая сыворотка с физиологическим раствором.
При первом контроле должно получиться белое кольцо, а при втором и третьем — кольцо отсутствует.
Постановка биологической пробы
Для постановки биологической пробы на животных часть исходного материала растирают в ступке со стерильным песком и небольшим количеством физиологического раствора. 0,5 см 3 взвеси впрыскивают двум белым мышам под кожу в области спины.
При исследовании материала от свиней (подчелюстные лимфатические узлы) опытных животных заражают только полученной чистой культурой.
В случае гибели мышей, что обычно наблюдается через 24—72 ч, их вскрывают: из крови сердца, печени, селезенки и места заражения приготовляют мазки, а из органов делают посевы.
В материале из свиней на мясо-пептонном агаре колонии сибиреязвенных бацилл могут быть атипичными, ослабленной вирулентности или невирулентными, но обладающими всеми другими характерными признаками сибиреязвенных возбудителей.
4.2.1.З. Обработка результатов
Основанием для постановки диагноза на сибирскую язву являются: наличие в мазках из патологического материала капсулообразующих палочек, а из колоний грамположительных — неподвижных бацилл; характерный рост на питательных средах; положительная реакция преципитации и положительный результат биологической пробы.
4.2.2 Выявление бактерий рожи свиней, листериоза и пасте-ре л л е з а
4.2.2.1. Сущность метода выявления бактерий рожи свиней, листериоза и пастереллеза заключается в определении специфического роста этих микроорганизмов на мясо-пептонном агаре и их дифференциации по морфологическим, культурным и биологическим свойствам.
4.2.2.2. Проведение исследования
Наличие роста на чашках с мясо-пептонным агаром мелких прозрачных колоний требует проведения исследований на присутствие бактерий рожи свиней, листериоза и пастереллеза. Из подозрительных колоний приготовляют мазки с окраской по Граму, исследуют на подвижность и производят посев на мясо-пептонный агар и мясо-пептонный бульон.
Дифференциальный диагноз рожи свиней и листериоза проводят в соответствии с показателями, указанными в табл. 1.