Структура хроматина смазана что это значит
Роль незрелого хроматина в мужском бесплодии
Внутриматочная инсеминация (ВМИ) была впервые применена как метод снижения фертильности около 200 лет назад. Это простое, недорогое и неинвазивное лечение бесплодия, которое является наиболее часто используемой вспомогательной репродуктивной технологией (ВРТ) во всем мире. Правильный отбор пациентов и подготовка спермы стали первым шагом к успеху программы ВМИ. На исход ВМИ влияет несколько факторов, таких как возраст, этиология и продолжительность бесплодия, толщина эндометрия, время овуляции, количество фолликулов, время и количество инсеминации. ВМИ был принят для лечения бесплодных пар с различными показаниями, включая легкое бесплодие по мужскому фактору; необъяснимое бесплодие и враждебность цервикальной слизи. Корреляция между качеством спермы и клиническими исходами была выявлена в условиях ВМИ. При рутинной подготовке спермы с использованием методов всплытия или градиента плотности сперматозоиды отбираются на основе прогрессивной подвижности, морфологических характеристик и концентрации для ВМИ. Эти параметры, однако, не могут гарантировать отбор сперматозоидов с нормальной целостностью ДНК / хроматина.
Некоторые авторы предположили, что исходы спермы с плохой морфологией сперматозоидов были сопоставимы с нормальной морфологией сперматозоидов в условиях ВМИ. Недавно было продемонстрировано, что как морфология сперматозоидов, так и прогрессивная подвижность имеют положительное влияние на результаты ВМИ. Другие обнаружили, что нормальная морфология сперматозоидов может рассматриваться как предиктор успеха ВМИ. Также Ван Вуртис и др. заметили, что сперма с менее чем 10 миллионами подвижных сперматозоидов была связана с более низкой частотой наступления беременности в циклах ВМИ. Было показано, что, когда количество подвижных сперматозоидов превышает 10 миллионов, не может быть достигнуто значительного увеличения частоты беременностей при ВМИ. В этом исследовании было продемонстрировано, что как количество сперматозоидов, так и прогрессирующая подвижность были ниже в случаях с легким мужским бесплодием по сравнению с женским бесплодием. Напротив, концентрация неподвижных сперматозоидов была выше у пациентов с мужским фактором и у небеременных пациентов по сравнению с другой группой. До подготовки спермы было обнаружено, что 30-50% общих подвижных сперматозоидов были связаны с положительными результатами ВМИ. Наши результаты показали, что показатели нормальной морфологии сперматозоидов были одинаковыми в обеих бесплодных группах. Следовательно, критерий морфологии сперматозоидов не может быть надежным прогностическим показателем для исхода ВМИ. Однако оценка целостности ДНК сперматозоидов может использоваться как фактор практической осуществимости, особенно у пациентов с мужским бесплодием. Результаты этого исследования показывают, что для выбора правильных кандидатов для клинической ВМИ необходимо выполнить цитохимические анализы для оценки целостности ДНК сперматозоидов пациентов. Эти анализы следует проводить в сочетании с анализом спермы, особенно у пациентов с мужским бесплодием. Это исследование также показало, что пациенты с легким мужским бесплодием не подходят для ВМИ, так как уровень незрелости хроматина в их сперматозоидах очень высок. Следовательно, им могут быть полезны другие методы АРТ, такие как ИКСИ.
В одном исследовании было известно, что структура хроматина сперматозоидов и целостность ДНК имеют решающее влияние на скорость оплодотворения. Конденсация хроматина сперматозоидов была показана с помощью анализа CMA3; указывает на протаминовые дефекты во время гистон-протаминовой замены конденсации хроматина сперматозоидов в тестикулярной фазе. В связи с этим Saleh et al. (2003) заявили, что бесплодные мужчины имеют более высокий уровень фрагментации ДНК сперматозоидов и дефектов хроматина. Они показали, что индекс фрагментации ДНК (DFI) напрямую связан с общей частотой наступления беременности. Аналогичным образом Bungum et al. также обнаружили, что пары, у которых не удалось забеременеть после ВМИ, имели повышенный уровень повреждения ДНК сперматозоидов. Вышеупомянутая группа также показала, что в случаях ВМИ, в которых повреждение ДНК сперматозоидов превышает 30%, показатели успешности беременности близки к нулю. В согласии с Салехом и др. Что касается дефектов хроматина, наша работа подтвердила, что уровень незрелости хроматина сперматозоидов значительно увеличился у бесплодных мужчин, а частота наступления беременности снизилась у мужчин с бесплодием. Анализ CMA3 кажется более эффективным, чем анализ апоптоза, который может быть использован в качестве надежного маркера для прогноза успеха беременности в программе IUI. Givercman et al. (2003) также полагали, что параметр анализа структуры хроматина сперматозоидов (SCSA) коррелирует с уровнем неподвижных сперматозоидов и процентом упаковки хроматина при АРТ. Однако они показали, что параметр DFI не зависит от подвижности сперматозоидов.
В 2007 году исследование показало, что 10–20% пациенток забеременели после программы ВМИ, что аналогично нашим случаям. Недавно Lucchini и ее коллеги сообщили о частоте исходов беременности в 11% от их суперовулированных случаев ВМИ. Доржпурев и др. оценили влияние характеристик спермы на успех ВМИ. Также они заявили, что некоторыми важными характеристиками беременности являются более молодой возраст, минимальная продолжительность бесплодия и факторы мужского бесплодия. Этот вывод также согласуется с отчетом Zadehmodarres et al. Более того, Доржпурев показал, что промывание / обработка спермы не повлияло на исход беременности. Они достигли аналогичных результатов для промытых и немытых образцов семенного материала. Однако лучше промыть эякуляты, чтобы отделить хорошую фракцию сперматозоидов от семенной плазмы, лейкоцитов и неподвижных сперматозоидов. Также обработка спермы подходит для предотвращения передачи инфекционных агентов и простагландинов в матку.
Структура хроматина смазана что это значит
• Структура хроматина меняется с участием комплексов ремоделирования, использующих энергию гидролиза АТФ
• SWI/SNF, RSC и NURF представляют собой большие комплексы, которые характеризуются наличием общих субъединиц
• Сам по себе комплекс ремоделирования не обладает специфичностью по отношению к определенному сайту, однако сборка его должна проходить с участием компонентов транскрипционного аппарата
• Комплексы ремоделирования собираются на промоторах под действием активаторов, специфичных по отношению к определенной нуклеотидной последовательности
• После связывания комплекса ремоделирования с хроматином, фактор может высвобождаться
Геном клетки характеризуется нуклеосомной организацией, однако если промоторная область содержит нуклеосомы, то инициации транскрипции обычно не происходит. При этом гистоны функционируют как репрессоры транскрипции (такое представление известно довольно давно). Процесс активации гена требует изменений в структуре хроматина: существенный момент состоит в том, каким образом аппарат транскрипции получает доступ к ДНК промоторной области.
Способность гена к экспрессии зависит как от локальной структуры хроматина (в промоторном сайте), так и от структуры окружающей области. Структура регулируется за счет местных процессов активации или же изменений, затрагивающих более обширную область хромосомы. К числу наиболее локальных относятся изменения в пределах индивидуального гена, когда изменения в структуре и организации нуклеосом происходят в непосредственной близости от промотора. Более обширные изменения могут затрагивать столь большие регионы, как целая хромосома.
Изменения, затрагивающие большие регионы, контролируют генную экспрессию. Для обозначения зарепрессированного гена в какой-либо области хромосомы используют термин молчащий ген. Под гетерохроматином понимают большие участки хромосом, под микроскопом характеризующиеся более компактной структурой. Молчащие гены и гетерохроматин характеризуются общей особенностью: в обоих случаях с хроматином связаны дополнительные белки, которые прямо или косвенно препятствуют факторам транскрипции и РНК-полимеразе активировать промоторы в определенной области.
Изменения того или иного промотора контролируют транскрипцию определенного гена. Эти изменения могут оказывать или активирующее, или репрессирующее действие.
Динамическая модель транскрипции хроматина основывается на существовании факторов,
способных использовать энергию гидролиза АТФ для вытеснения нуклеосом с участков специфических последовательностей ДНК.
Изменения локальной структуры хроматина представляют собой составную часть процесса контроля генной экспрессии. Гены могут существовать в одном из двух структурных состояний. Гены находятся в «активном» состоянии только в клетках, в которых они экспрессируются. Изменения их структуры предшествуют транскрипции и указывают на то, что ген является «транскрибируемым». Это позволяет предполагать, что приобретение геном «активной» структуры должно быть первым шагом на пути его экспрессии. Активные гены находятся в доменах эухроматина, обладающих повышенной чувствительностью к нуклеазам. Гиперчувствительные сайты создаются на промоторах до момента активации гена.
Между инициацией транскрипции и структурой хроматина существует тесная и постоянная связь. Некоторые активаторы процесса транскрипции непосредственно модифицируют гистоны; в особенности с активацией генов связан процесс их ацетилирования. Напротив, некоторые репрессоры транскрипции деацетилируют гистоны. Таким образом, экспрессия генов контролируется структурным состоянием гистонов поблизости от промотора. Это может представлять собой часть механизма, посредством которого ген поддерживается в активном или неактивном состоянии.
Механизм поддержания локальных участков хроматина в неактивном (молчащем) состоянии связан с механизмом репрессии индивидуального промотора. Белки, ответственные за образование гетерохроматина, действуют на хроматин через гистоны, и модификация гистонов может быть важным этапом его образования.
Суммарный процесс реализации изменений структуры хроматина называется ремоделированием хроматина. Он включает в себя механизмы удаления гистонов, которые зависят от поступления энергии. Для удаления гистонов из хроматина необходимо разрушение многих белок-белковых и ДНК-белковых связей. Это не так просто: для диссоциации этих связей требуется энергия. На рисунке ниже представлен принцип динамического ремоделирования хроматина с участием фактора, гидролизующего АТФ. Когда из хроматина высвобождается октамер гистонов, с ДНК могут связываться другие белки (в данном случае факторы транскрипции и РНК-полимераза).
На рисунке ниже суммированы типы изменении, происходящих при ремоделировании хроматина, которые могут быть охарактеризованы in vitro:
• Октамеры гистонов могут продвигаться по ДНК, изменяя соотношение между нуклеиновой кислотой и белком. Это приводит к изменению положения определенных последовательностей ДНК на поверхности нуклеосомы.
• Расстояние между октамерами гистонов может изменяться, что приводит к изменению положения определенных последовательностей по отношению к белку.
• Наиболее радикальные изменения состоят в том, что октамеры гистонов могут полностью удаляться с ДНК, образуя участки, не содержащие нуклеосом. Наиболее часто ремоделирование хроматина происходит при изменении организации нуклеосом в области промотора транскрибируемого гена. Это необходимо для обеспечения доступа аппарата транскрипции к промотору. Однако ремоделирование хроматина также необходимо для обеспечения протекания других процессов, таких как репарация повреждений в ДНК.
Наиболее часто при ремоделировании удаляется один или более октамеров гистонов. Это может быть обнаружено по изменениям характера деградации ДНК хроматина под действием микрококковой нуклеазы: наблюдается утрата сайтов, защищенных от расщепления. Часто при этом возникают сайты, характеризующиеся повышенной чувствительностью к действию ДНКазы I. Иногда наблюдаются менее выраженные изменения, например касающиеся положения отдельной нуклеосомы; это можно определить по утрате лесенки через 10 пн, которая образуется после обработки ДНКазы I. Таким образом, изменения в структуре хроматина варьируют от изменения положения нуклеосом до полного их удаления.
Ремоделирование хроматина осуществляется с участием больших комплексов, которые используют АТФ в качестве источника энергии, необходимой для осуществления этого процесса. Центральным компонентом комплекса является субъединица АТФазы. Обычно комплексы классифицируют в соответствии с типом этой субъединицы — комплексы с близким типом обычно причисляют к одному типу (обычно они содержат также другие общие субъединицы). В таблице на рисунке ниже даны названия этих субъединиц. Два основных типа комплексов представлены SWI/SNF и ISW (ISW заменяет SWI). Дрожжи содержат два комплекса каждого типа. Комплексы обоих типов также находятся у дрозофилы и человека. Каждый тип комплекса может проявлять различную активность при ремоделировании хроматина.
Ремоделирующий комплекс может вызывать скольжение нуклеосом вдоль ДНК,
вытеснять нуклеосомы или изменять расстояние между ними.
Комплексы SWI/SNF могут ремоделировать хроматин in vitro или без потери всех гистонов, или с удалением их октамеров. Для обоих процессов характерно общее промежуточное состояние, при котором структура нуклеосомы — мишени меняется, приводя или к повторному образованию (ремоделированию) нуклеосомы на той же ДНК, или к перемещению октамера гистонов на другую молекулу ДНК. Комплекс SWI/SNF меняет чувствительность нуклеосомной ДНК к ДНКазе I и изменяет ДНК-белковые контакты, которые сохраняются после ее высвобождения из нуклеосом. Субъединица SWI2 представляет собой АТФазу, которая обеспечивает энергией процесс ремоделирования, осуществляемый с помощью SWI/SNF.
Между ДНК и октамером гистонов существует много точек связывания — по результатам исследования кристаллической структуры их насчитывается 14. Для того чтобы октамер сместился на новую позицию или же полностью потерял связь с ДНК, должны разорваться связи во всех точках контакта ДНК с белком. Каким образом это происходит? Некоторые механизмы можно исключить, поскольку мы знаем, что при ремоделировании однонитевая ДНК не образуется (и комплексы не обладают хеликазной активностью). Согласно современному представлению, комплексы, относящиеся к классам SWI и ISW, используют энергию гидролиза АТФ для раскручивания ДНК на поверхности нуклеосомы. Некоторые косвенные данные свидетельствуют о том, что при этом создается механическое усилие, которое позволяет небольшому участку ДНК отсоединиться от поверхности и занять новую позицию.
Одним из важных процессов, катализируемых комплексами ремоделирования, является скольжение нуклеосом. Сначала оказалось, что комплекс группы ISW изменяет положение нуклеосомы, но не вызывает отрыва коровой частицы от ДНК. Это достигается за счет скольжения, при котором октамер перемещается вдоль ДНК. Удаление N-терминального участка гистона Н4 предотвращает скольжение, однако мы достоверно не знаем, каким образом эта часть молекулы гистона участвует в перемещении. Комплексы SWI/SNF обладают такими же свойствами; процесс блокируется при создании барьера на ДНК. Это позволяет считать, что мы имеем дело с реакцией скольжения, при которой октамер гистонов более или менее непрерывно движется вдоль ДНК, не теряя с ней контакта.
Одна из загадок функционирования комплекса SWI/SNF заключается в его размере. Комплекс состоит из 11 субъединиц и обладает суммарной молекулярной массой 2 х 106. Он должен мешать функционированию РНК-полимеразы и нуклеосом. Кроме того, непонятно, каким образом все компоненты комплекса взаимодействуют с ДНК, которая удерживается на поверхности нуклеосомы. Однако обнаружен транскрипционный комплекс, обладающий полной активностью, который называется РНК-полимераза II холофермент. Он содержит саму РНК-полимеразу, все TFII факторы, за исключением TBP и TFIIA, и комплекс SWI/SNF, который связан с CTD концевым участком молекулы полимеразы. Фактически препараты холофермента могут содержать весь комплекс SWI/SNF. Это позволяет предполагать, что ремоделирование хроматина и узнавание промоторов являются скоординированными процессами и осуществляются с участием одного комплекса.
Каким образом комплексы присоединяются к определенным сайтам хроматина при ремоделировании? Сами по себе они не содержат субъединиц, связывающихся со специфическими последовательностями в ДНК. Поэтому предложена модель, согласно которой функционирование комплексов зависит от активаторов или (иногда) от репрессоров. Модель функционирует по механизму «hit and run», при котором после связывания комплекса ремоделирования активатор или репрессор удаляется.
Ремоделирование хроматина достигается за счет изменений в состоянии гистонов, в особенности модифицирования N-терминальных участков гистонов Н3 и Н4. Эти участки включают 20 N-терминальных аминокислот и отходят от нуклеосомы, располагаясь между витками ДНК. Они могут быть модифицированы по нескольким сайтам за счет метилирования, ацетилирования или фосфорилирования. При модификации гистонов создаются сайты связывания для негистоновых белков, в результате чего изменяются свойства хроматина.
Количество нуклеосом, белки которых подвергаются модификации, различно. Модификация может быть локальной и, например, ограничиваться нуклеосомами, расположенными в области промотора. Она может представлять собой более общий процесс и затрагивать хромосому целиком. Рисунок ниже иллюстрирует положение, согласно которому ацетилирование связано с активацией хроматина, а метилирование вызывает его инактивацию. Впрочем, это простое правило выполняется не всегда, и важную роль играет характер модифицируемого сайта, а также сочетание различных модификаций. Поэтому известны исключения, когда, например, в активном хроматине находятся гистоны, метилированные в определенных положениях.
О специфичности модификаций свидетельствуют данные о том, что для многих ферментов на отдельных гистонах существуют специфические сайты. В таблице на рисунке ниже перечислены некоторые модификации. Большинство сайтов подвергается только одному типу модификации. В некоторых случаях модификация одного сайта может оказывать активирующее или ингибирующее действие на модификацию другого. Представление о том, что комбинация сигналов может быть использована для определения типа хроматина, иногда называется гистоновый код.
Ремоделирующие комплексы подразделяются на типы в зависимости от природы АТФазных субъединиц. 
Ремоделирующий комплекс связывается с хроматином посредством активатора (или репрессора). 
Ацетилирование гистонов Н3 и Н4 характерно для активного хроматина,
в то время как метилирование для неактивного. 
Большинство сайтов в гистонах подвержены одному, определенному типу модификации,
однако некоторые из них могут модифицироваться разными ферментами.
С некоторыми из этих модификаций могут быть связаны определенные функциональные изменения.
Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021
Неуловимая архитектура хроматина мухи
Архитектура хроматина одиночных клеток плодовой мушки дрозофилы оказалась намного более предсказуемой, чем ожидалось
Автор
Редакторы
Рецензенты
Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Судьба клетки во многом определяется тем, как ее гены, закодированные в ДНК, считываются и работают. Мы узнаём всё больше о том, как в этом процессе важна пространственная организация хроматина (иными словами — его архитектура). Структурная биология хроматина — большая и кипучая область, и именно здесь можно придумать и поставить такой эксперимент, который прояснит фундаментальные принципы жизни клетки. Мне удалось стать не только свидетелем, но и участником такого события. С помощью непростого эксперимента фиксации конформации хромосом одиночных клеток мы предположили два возможных механизма формирования структуры хроматина мухи, тесно связанных с активностью генов. Более того, мы выяснили ряд особенностей хроматина этого организма. На пути к открытию пришлось преодолеть всевозможные трудности. И теперь, когда работа опубликована в Nature Communications, я делюсь рассказом о том, почему это было не только трудно, но и интересно.
Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021
Эта работа опубликована в номинации «Своя работа» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Трехмерная структура хроматина одиночных клеток
Петли (loops) — неоднозначный термин в области биологии хроматина. В данном случае мы используем его как синоним пиков (peaks), которые видны на Hi-C-картах как яркие сигналы вне главной диагонали [3].
Отчасти причина в том, что Hi-C — это метод высокопроизводительного секвенирования, для которого требуется много ДНК: несколько десятков микрограммов. Чтобы получить такое количество ДНК, ученые проводят эксперимент на миллионах клеток. К сожалению, при этом не получается учесть, что каждая клетка и набор ее контактов ДНК — уникальны. Трехмерная организация хроматина одиночного ядра является следствием индивидуального процесса упаковки длинной молекулы ДНК под влиянием термодинамического движения молекул и никогда не повторяется. Глядя на миллионы прочтений после секвенирования, мы не можем назвать те контакты, которые встретились в одном ядре одновременно.
Прочтения, или риды (reads), — это последовательности нуклеотидов, которые можно получить из образца ДНК с помощью секвенирования [4]. Хотя существуют разнообразные методы секвенирования [5], в этой работе мы использовали один из самых эффективных и популярных: секвенирование нового поколения с помощью Illumina. Это высокопроизводительный метод, позволяющий прочитать сотни гигабайт последовательностей ДНК. Именно с этих данных начинается вычислительная работа: прочтения картируют и ищут в них контакты ДНК.
Более того, нам важно не только узнать набор контактов ДНК, но и реконструировать те физические процессы, которые, возможно, привели к тому, что сформировался именно такой набор контактов. К сожалению, такая реконструкция становится сложной и дает неоднозначные и трудно интерпретируемые результаты, если неизвестно, какие контакты ДНК имеются в одной клетке. Чтобы решить эту проблему, удалось интегрировать два экспериментальных протокола. Часть была взята от методов секвенирования геномов одиночных клеток [6], а часть — от Hi-C, и в итоге получилась техника single-cell Hi-C, или Hi-C одиночных клеток (рис. 1) [7].
Рисунок 1. Протокол Hi-C одиночных клеток. В Hi-C одиночных клеток первые этапы напоминают традиционное Hi-C на популяции: хроматин фиксируется, фрагментируется и сшивается с помощью лигазы. На следующем этапе, важном именно для данного протокола, каждая клеточка попадает в собственную лунку с помощью клеточного сортера (FACS). В каждой лунке оказывается порядка одного пикограмма ДНК. Этого недостаточно для того, чтобы прочитать ее последовательность с помощью методов высокопроизводительного секвенирования! Проблему решает амплификация с помощью специальной процессивной полимеразы фага phi29, которая значительно увеличивает количество копий ДНК. Такую амплифицированную ДНК уже можно отправлять на секвенирование и начинать обработку массивных данных.
Сшивки ДНК одиночных клеток
В казалось бы простом экспериментальном протоколе нашлось место и «подводным камням». Оказалось, что полимераза Phi29, с помощью которой мы амплифицировали геномную ДНК индивидуальных клеток, может совершать случайные «прыжки» между молекулами ДНК (рис. 2). Это приводит к возникновению искусственных сшивок, которые традиционные алгоритмы обработки данных Hi-С не отличают от настоящих контактов, образовавшихся в ядре клетки.
Рисунок 2. Последовательность манипуляций с ДНК в протоколе Hi-C одиночных клеток.
иллюстрация Михаила Гурьева
К счастью, нашелся способ отличить настоящие и фальшивые контакты. Дело в том, что при лигировании соединение фрагментов происходит только по сайтам рестрикции, которые легко можно найти в последовательности ДНК. Прыжки полимеразы, напротив, происходят случайно и не имеют характерной подписи.
После картирования отдельно взятого прочтения Hi-C можно обнаружить стык лигирования и проверить, что он совпадает с сайтом рестрикции: значит, такому контакту можно доверять, с большой вероятностью он произошел в результате пространственного сближения и лигирования фрагментов хроматина внутри ядра. А по позициям картирования этих участков на геноме можно определить, какие участки ДНК последовательно соединялись в ходе эксперимента.
Чтобы вычислительно реализовать эту процедуру обработки данных, мы разработали алгоритм ORBITA (One-Read Based InTeractions Annotation), основанный на программе pairtools (рис. 3) [8]. Он позволяет извлекать и фильтровать настоящие сшивки ДНК, которые произошли в ходе пространственно-зависимого лигирования в ядре. Масштабное сравнение с подходом, который использовался ранее [9], [10], показало, что фильтрация по сайтам рестрикции помогает находить достоверные контакты Hi-C одиночных клеток и улучшает анализ.
Рисунок 3. ORBITA-подход для получения настоящих контактов Hi-C одиночных клеток
Совпадение или правило?
После того, как отлажена техника работы с Hi-C одиночных клеток, можно перейти к самому интересному — наблюдениям за новыми свойствами и механизмами формирования пространственной структуры хроматина. Пожалуй, самый интересный вопрос — являются ли механизмы и способы укладки хроматина разных организмов универсальными? Ранее Hi-C одиночных клеток проводили только для млекопитающих. Одно из важных наблюдений состояло в том, что хроматин одиночных клеток образует разбросанные по геному домены (участки с повышенной частотой контактов внутри).
Теперь же мы применили Hi-C для одиночных клеток плодовой мушки дрозофилы [11]. Оказалось, что хроматин и этого организма в каждой отдельно взятой клетке сформирован из топологически ассоциированных доменов (ТАДов), однако структуры эти гораздо более упорядочены, чем у млекопитающих (рис. 4).
Рисунок 4. Сравнение результатов «популяционного» и «одноклеточного» Hi-C. Регион генома на традиционном популяционном Hi-C (верхняя панель), в объединении контактов 20 клеток (вторая панель) и в нескольких индивидуальных клетках дрозофилы. ТАДы видны как увеличенное количество контактов на участке («треугольники»). Положение ТАДов в индивидуальных клетках часто совпадает, а значит, что ТАДы — это довольно стабильные структурные единицы хроматина дрозофилы.
Конечно, совпадение позиций ТАДов может оказаться случайным, без какой-либо биологической причины. В данном случае с помощью моделирования и статистических тестов мы доказали, что относительно консервативные в разных клетках позиции ТАДов дрозофилы действительно являются следствием какого-то биологического механизма.
Каким может быть этот механизм? На наш взгляд, возможны как минимум два сценария (рис. 5). Хроматин дрозофилы может обладать особенными свойствами липкости, которые приводят к образованию стабильных конгломератов ДНК. Альтернативное объяснение — механизм выпетливания ДНК с помощью специальных факторов экструзии, которые останавливаются на участках ДНК, где располагаются активные гены. Обе эти гипотезы согласуются с тем, что известно о хроматине эукариот, однако для проверки этих гипотез требуются более детальные исследования (и, возможно, с помощью других методов).
Рисунок 5. Гипотезы формирования стабильных доменов в хроматине дрозофилы
Многолетняя коллаборация
Все эти исследования выполнялись в многолетней коллаборации, объединившей усилия ученых из Сколтеха, Института биологии гена РАН и МГУ им. М.В. Ломоносова, Национального центра научных исследований Франции, российско-французского Центра Понселе и нескольких других организаций.
Каждый из участников взял на себя отдельную важную роль, без которой проект не смог бы состояться. Так, Сергей Ульянов и Влада Захарова провели отработку экспериментальной техники. Моя роль заключалась в разработке вычислительных подходов и интерпретации данных. Павел Кос создал метод моделирования структуры хроматина единичных клеток дрозофилы. Кирилл Половников показал, что данные действительно отличаются от шума. Часть экспериментов провел наш давний коллаборатор Илья Флямер, который ранее применял подобную технику для исследования структуры хроматина ооцитов и зигот мыши [9], [10].
Похожий подход можно масштабировать и исследовать с его помощью разнообразие архитектур хроматина одиночных клеток, тканей и даже целых организмов. А пока что нам удалось зафиксировать неуловимую архитектуру хроматина клеток плодовой мушки и сформулировать гипотезы об упаковке ДНК этого организма. Подробности можно прочитать в журнале Nature Communications, где недавно вышла публикация о работе [12].
Работа поддержана грантами РФФИ №19-34-90136 и РНФ №19-14-00016.