реакция на пероксидазу рыбы
6.2.4 Постановка редуктазной пробы
Редуктазная проба служит косвенным подтверждением бактериальной обсемененности мяса. Гнилостные микроорганизмы выделяют различные ферменты и, в частности, восстанавливающий фермент – редуктазу. Наличие редуктазы и ее активность определяют с помощью окислительно-восстановительных индикаторов. Под воздействием редуктазы последние обесцвечиваются. В качестве индикатора применяют метиленовый голубой (метиленовую синь). Чем быстрее произойдет обесцвечивание вытяжки из рыбы, к которой добавлен раствор метиленового голубого, тем активнее редуктаза, а, следовательно, и больше гнилостных микроорганизмов.
Оценка результатов Экстракт из несвежей рыбы обесцвечивается через 20 – 40 минут.
Экстракт из рыбы сомнительной свежести обесцвечивается в течение от 40 мин до 2,5 часов.
Экстракт из свежей рыбы обесцвечивается позднее 2,5 часов.
При учете результатов реакции сохранение синего кольца под слоем вазелинового масла в расчет не принимают.
6.2.5 Реакция на пероксидазу с вытяжкой из жабр
Жабры рыбы в первую очередь подвергаются порче. Поскольку в них активно происходят окислительные процессы, то вместе с кровью там присутствует фермент пероксидаза. По активности этого фермента судят о степени свежести мяса рыбы.
Сущность реакции заключается в том, что находящийся в мясе фермент пероксидаза разлагает перекись водорода с образованием кислорода, который и окисляет бензидин. При этом образуется парахинондиимид, который с недоокисленным бензидином дает соединение сине – зеленого цвета, переходящего в бурый.
Оценка результатов. Реакция на пероксидазу с вытяжкой из жабр свежей рыбы – положительная, сине-зеленое окрашивание быстро переходит в бурый цвет; сомнительной свежести – слабо – положительная, сине-зеленое окрашивание с задержкой переходит в бурый цвет; несвежей рыбы – отрицательная, цвет остается без изменений.
7 Вопросы для самоконтроля знаний
1. Какие факторы способствуют быстрой порче рыбы?
2. Каковы принципы отбора проб рыбы при определении степени ее свежести?
3. По каким органолептическим показателям определяют степень свежести рыбы?
4. Каковы методики определения наличия аммиака и солей аммония в рыбе?
5. Каковы методы определения бактериальной загрязненности рыбы?
6. В чем состоит сущность реакции на пероксидазу?
7. Методика определения рН мяса рыбы и оценка результатов.
Реакция на ПЕРОКСИДАЗУ с вытяжкой из жабр
(по А.М. Полуэктову)
В жабрах при жизни рыбы происходят окислительные процессы под воздействием фермента пероксидазы, содержащейся в гемоглобине крови. Оптимальным для действия пероксидазы является рН 4,3.
Гнилостные процессы в жабрах начинаются в ранних стадиях разложения рыбы, сопровождаются распадом крови и накоплением щелочных продуктов, вследствие чего снижается концентрация водородных ионов.
Поэтому реакция на пероксидазу с вытяжкой из жабр свежей рыбы положительная, а в ранних стадиях разложения рыбы (при рН жабр 6,7 и выше) становится отрицательной.
Фильтрат из жабр свежей рыбы окрашивается в сине-зеленый цвет, переходящий в бурый; фильтрат из жабр недоброкачественной рыбы остается без изменений.
Реакция на АММИАК
(применима только для несоленой рыбы и соленой несозревшей)
Необходимы:
Порядок работы:
В широкую пробирку наливают 2-3 мл смеси Эбера, закрывают пробирку, через которую продета тонкая стеклянная палочка с загнутым концом. На конец палочки укрепляют кусочек исследуемого мяса рыбы.
Оценка реакции: появление облачка хлористого аммония указывает на наличие свободного аммиака. Отмечают интенсивность реакции:
реакция слабоположительная + (быстро исчезающее расплывчатое облачко);
реакция положительная ++ (устойчивое облачко);
реакция резко положительная +++ (облачко появляется немедленно по внесению мяса в пробирку с реактивом).
ПО РАЗЛИЧНЫМ ПРИЗНАКАМ
ЛИТЕРАТУРА
1. Антипова, Л. В. Методы исследования мяса и мясных продуктов / Л. В. Антипова, И. А. Глотова, И. А. Рогов. – М.: Колос. 2001.
2. Боровков, М. Ф. Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии и стандартизации продуктов животноводства: Учебник / Под ред. проф. М. Ф. Боровкова. 2-е изд., стер. / М. Ф. Боровков, В. П. Фролов, С. А. Серко. – Издательство «Лань». 2008. – 448 с.
3. Житенко, П. В. Ветеринарно-санитарная экспертиза продуктов животноводства: Справочник / П. В. Житенко, М. Ф. Боровков. – М.: Колос. 2000. – 335 с.
5. Крусь, Г. Н. Методы исследования молока и молочных продуктов / Г. Н. Крусь, А. М Шалыгина.- М.: «Колос». 2000. – 368 с.
6. Правила ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов / под ред. И. А. Рыбина. – М.: Агропромиздат. 1988. – 62 с.
8. Сборник нормативно-правовых документов по ветеринарно-санитарной экспертизе мяса и мясопродуктов: Учебное пособие / Сост. В. Г. Урбан; под ред. Е. С. Воронина. – СПб.: Издательство «Лань». 2010. – 384 с.
9. Серегин, И. Г. Ветеринарно-санитарная экспертиза пищевых продуктов на продовольственных рынках: Учебное пособие / И. Г. Серегин, М. Ф. Боровков, В. Е. Никитченко. – СПб.: ГИОРД, 2008. – 478 с.
10. Смирнов, А. В. Практикум по ветеринарно-санитарной экспертизе: Учебное пособие / А. В. Смирнов. – СПб.: ГИОРД. 2009. – 336 с.
Лабораторные исследования на доброкачественность
1. Лабораторное исследование рыбы проводится при невозможности дать заключение о качестве продукта по органолептическим показателям рыбы трех сортов (по требованию саннадзора, госрыбинспекции).
2. Доброкачественность рыбы определяется следующими лабораторными способами:
б) определение среды на лакмус (рН при помощи рН-метра);
в) открытием свободного аммиака или числа Несслера;
г) открытием сероводорода;
д) определением рН в экстракте из мышц.
Препараты подсушивают на воздухе, фиксируют трехкратным проведением над пламенем горелки и окрашивают по Граму.
Рыбасвежая микрофлоры не содержит, могут встречаться лишь единичные кокки и палочки. Препарат из свежей рыбы окрашивается плохо, на стекле не заметно остатков разложившейся ткани.
Концентрация водородных ионов (рН)
Свежая рыба имеет рН до 6,9; сомнительной свежести – 7,0-7,2; недоброкачественная – 7,3 и выше
Реакция на СЕРОВОДОРОД (по Пуйдаку)
Оборудование и реактивы:
10% щелочной раствор уксуснокислого свинца; бюксы на 50 мл с крышечкой; исследуемая рыба 25-15 г; стеклянная палочка; песочные часы на 15 мин.; 20% раствор едкого натра; 4% раствор уксуснокислого свинца; белая фильтровальная бумага.
Порядок работы
15-20 г фарша помещают рыхлым слоем в бюксы емкостью 40-50 мл. В бюксе подвешивают горизонтально над фаршем полоску плотной фильтровальной бумаги, обращенной к фаршу стороной, на которую были нанесены 3-4 капли раствора свинцовой соли. Диаметр капель 2-3 мм.
Расстояние между бумагой и поверхностью фарша должно быть около 1 см. Бюкс закрывают крышкой, зажимая фильтровальную бумагу и оставляют стоять при комнатной температуре 15 мин. Затем сравнивают окраску бумажек бывшей в бюксе и смоченной тем же раствором свинцовой соли (контрольный опыт);
В зависимости от изменения цвета бумажки, смоченной раствором уксуснокислого свинца, в бурый или черный цвет реакцию оценивают в крестах следующим образом:
Реакция на ПЕРОКСИДАЗУ с вытяжкой из жабр
(по А.М. Полуэктову)
В жабрах при жизни рыбы происходят окислительные процессы под воздействием фермента пероксидазы, содержащейся в гемоглобине крови. Оптимальным для действия пероксидазы является рН 4,3.
Гнилостные процессы в жабрах начинаются в ранних стадиях разложения рыбы, сопровождаются распадом крови и накоплением щелочных продуктов, вследствие чего снижается концентрация водородных ионов.
Поэтому реакция на пероксидазу с вытяжкой из жабр свежей рыбы положительная, а в ранних стадиях разложения рыбы (при рН жабр 6,7 и выше) становится отрицательной.
Фильтрат из жабр свежей рыбы окрашивается в сине-зеленый цвет, переходящий в бурый; фильтрат из жабр недоброкачественной рыбы остается без изменений.
Реакция на АММИАК
(применима только для несоленой рыбы и соленой несозревшей)
Необходимы:
Порядок работы:
В широкую пробирку наливают 2-3 мл смеси Эбера, закрывают пробирку, через которую продета тонкая стеклянная палочка с загнутым концом. На конец палочки укрепляют кусочек исследуемого мяса рыбы.
Оценка реакции: появление облачка хлористого аммония указывает на наличие свободного аммиака. Отмечают интенсивность реакции:
реакция слабоположительная + (быстро исчезающее расплывчатое облачко);
реакция положительная ++ (устойчивое облачко);
реакция резко положительная +++ (облачко появляется немедленно по внесению мяса в пробирку с реактивом).
ПО РАЗЛИЧНЫМ ПРИЗНАКАМ
ЛИТЕРАТУРА
1. Антипова, Л. В. Методы исследования мяса и мясных продуктов / Л. В. Антипова, И. А. Глотова, И. А. Рогов. – М.: Колос. 2001.
2. Боровков, М. Ф. Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии и стандартизации продуктов животноводства: Учебник / Под ред. проф. М. Ф. Боровкова. 2-е изд., стер. / М. Ф. Боровков, В. П. Фролов, С. А. Серко. – Издательство «Лань». 2008. – 448 с.
3. Житенко, П. В. Ветеринарно-санитарная экспертиза продуктов животноводства: Справочник / П. В. Житенко, М. Ф. Боровков. – М.: Колос. 2000. – 335 с.
5. Крусь, Г. Н. Методы исследования молока и молочных продуктов / Г. Н. Крусь, А. М Шалыгина.- М.: «Колос». 2000. – 368 с.
6. Правила ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов / под ред. И. А. Рыбина. – М.: Агропромиздат. 1988. – 62 с.
8. Сборник нормативно-правовых документов по ветеринарно-санитарной экспертизе мяса и мясопродуктов: Учебное пособие / Сост. В. Г. Урбан; под ред. Е. С. Воронина. – СПб.: Издательство «Лань». 2010. – 384 с.
9. Серегин, И. Г. Ветеринарно-санитарная экспертиза пищевых продуктов на продовольственных рынках: Учебное пособие / И. Г. Серегин, М. Ф. Боровков, В. Е. Никитченко. – СПб.: ГИОРД, 2008. – 478 с.
10. Смирнов, А. В. Практикум по ветеринарно-санитарной экспертизе: Учебное пособие / А. В. Смирнов. – СПб.: ГИОРД. 2009. – 336 с.
Приложение 6. Лабораторные методы определения свежести рыбы
Лабораторные методы определения свежести рыбы
При обнаружении признаков несвежести рыбы проводят лабораторные исследования: бактериоскопию, определяют сероводород с подогреванием пробы и концентрацию водородных ионов (рН), содержание амино-аммиачного азота и продуктов первичного распада белков в бульоне (реакция с сернокислой медью), ставят реакцию на пероксидазу и редуктазную пробу, проводят люминесцентный анализ. В необходимых случаях для характеристики пищевых и кормовых достоинств рыбы дополнительно определяют химический состав, биологическую ценность (безвредность, питательность), видовую принадлежность микроорганизмов и содержание влаги в мясе исследуемых рыб. В малооборудованных лабораториях для оценки доброкачественности рыбы ограничиваются бактериоскопией мазков-отпечатков, реакцией на пероксидазу или редуктазу, определением сероводорода, рН и безвредности рыбы.
Определение рН. К 5 г фарша мяса рыбы добавляют 50 мл дистиллированной воды и настаивают в течение 30 минут при периодическом помешивании, фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат используют для исследования. Определяют рН потенциометром (рН-метром) или индикаторной бумагой. У рыбы свежей фильтрат слегка опалесцирует, рН до 6,9; у рыбы сомнительной свежести фильтрат слегка мутноватый, рН 7,0-7,2; у рыбы несвежей фильтрат мутный, запах неприятный, рН 7,3 и выше.
Определение содержания амино-аммиачного азота. В колбу емкостью 100 мл к 10 мл профильтрованной через фильтровальную бумагу водной вытяжки из мяса (1:4) добавляют 40 мл дистиллированной воды и три капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина. Содержимое колбы нейтрализуют децинормальным раствором едкого натра до слабо-розового окрашивания. Затем в колбу добавляют 10 мл формалина, нейтрализованного по фенолфталеину до слабо-розовой окраски. В результате освобождения карбоксильных групп смесь становится кислой и розовый цвет индикатора исчезает. После этого содержимое колбы снова титруют децинормальным раствором едкого натра до слабо-розовой окраски. Так как 1 мл децинормального раствора едкого натра эквивалентен 1,4 мг азота, то количество миллилитров децинормального раствора едкого натра, пошедшего на второе титрование, умножают на 1,4 и получают в мг количество аммиачного азота в 10 мл фильтрата мясной вытяжки.
Метод определения продуктов первичного распада белков в бульоне (реакция с сернокислой медью). В 200 мл коническую колбу Эрленмейера помещают 20 г фарша из спинных мышц рыбы, добавляют 60 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Колбу накрывают часовым стеклом и нагревают в течение 10 минут в кипящей водяной бане. Затем горячий бульон фильтруют через плотный слой бумажно-ватного фильтра в пробирку, помещенную в стакан с холодной водой. Если в фильтрате остаются хлопья белка, то его снова фильтруют через фильтровальную бумагу.
После фильтрации 2 мл бульона наливают в пробирку и добавляют три капли 5%-ного раствора сернокислой меди, встряхивают 2-3 раза и выдерживают 5 минут. Контролем служит бульон в пробирке без добавления сернокислой меди.
Реакция на пероксидазу (бензидиновая проба). В бактериологическую пробирку вносят 2 мл водной вытяжки (1:10) из жаберной ткани (по А.М. Полуэктову) и добавляют 5 капель 0,2%-ного спиртового раствора бензидина. Содержимое пробирки взбалтывают, после чего вносят две капли 1%-ного раствора перекиси водорода.
Вытяжка из жаберной ткани рыб дает синюю окраску, переходящую в течение 1-2 минут в коричневую.
Вытяжка из жаберной ткани рыб сомнительной свежести дает менее интенсивную окраску и значительно позже переходит в коричневую (через 3-4 минуты).
Вытяжка из жаберной ткани несвежей рыбы не дает синей окраски, а непосредственно переходит в коричневый цвет (отрицательная реакция на пероксидазу).
Редуктазная проба. В бактериологическую пробирку вносят 5 г фарша из мяса рыбы, заливают двойным количеством дистиллированной воды, встряхивают и оставляют на 30 минут. Затем приливают 1 мл 0,1%-ного водного раствора метиленовой сини, пробирку энергично встряхивают для равномерной окраски фарша, заливают слоем вазелинового масла толщиной 0,5-1 см. Реакционную смесь помещают в термостат при 37° и периодически ведут наблюдение за обесцвечиванием экстракта. Чем быстрее произойдет обесцвечивание вытяжки из рыбы, к которой добавлен метиленовый голубой, тем больше содержится в ней фермента редуктазы (дегидразы), а следовательно, и больше микроорганизмов, его продуцирующих.
Определение качества термической обработки мясных и рыбных изделий (проба на пероксидазу)
Метод определения с помощью этой тест-системы основан на разложении перекиси водорода ферментом пероксидазой, содержащимся в крови. Активный кислород, освобождающийся при разложении перекиси водорода, окисляет бензидин. В результате окисления бензидина образуется парахинондиимид синего цвета («бензидиновая синь»).
На тест-систему «Контроль полноты термической обработки (Пероксидаза-тест)», как и на все остальные тест-системы производства ГК «Крисмас», получен сертификат соответствия, ее серийный выпуск полностью соответствует требованиям нормативных документов ТУ 2642-710-82182574-14.
Поскольку пероксидаза — фермент, содержащийся в крови, свойственный живым тканям, то свежее мясо (либо термически недостаточно обработанное) даёт положительную реакцию на пероксидазу, выражающуюся в появлении синей окраски. Соответственно, мясо после достаточной термической обработки даёт отрицательную реакцию.
Определение можно описать следующими схемами:
Для комфортной работы с данной тест-системой, для её более эффективного использования и получения максимально верных результатов исследований, ГК «Крисмас» производит и поставляет специальный комплект принадлежностей к тест-системам для санитарно-пищевого экспресс-контроля.
Выполнение определения
1. Непосредственно перед проведением анализа произведите лезвием ножа глубокий разрез на мясном или рыбном термически обработанном кулинарном изделии в продольном направлении до середины.
2. Отрежьте от полоски фильтровальной бумаги рабочий участок примерно 1×1 см.
3. Смочите рабочий участок из полимерной пипетки раствором бензидина (1 капля), затем раствором перекиси водорода (1 капля).
Примечание.
Соблюдайте меры безопасности при работе с раствором бензидина. Пользуйтесь защитными перчатками и очками. При выполнении экспресс-контроля следует для каждого реактива обязательно использовать индивидуальные пипетки. Реактивы входящие в состав тест-системы не являются опасными и вредными для здоровья человека, но все же рекомендуется избегать их попадания на кожу и слизистые. В случае попадания просто промыть водой.
4. Поместите смоченный рабочий участок с помощью пинцета в середину разреза мясного или рыбного изделия на 1 минуту, прижимая бумагу пинцетом к изделию.
Оценка результатов
Посинение бумаги в течение не более 1 мин указывает на недостаточную термическую обработку продукта (положительная реакция на пероксидазу).
При достаточной термической обработке продукта окрашивания бумаги не происходит (отрицательная реакция на пероксидазу).
Примечание. Посинение бумаги более чем через 2 минуты может быть вызвано разложением реагентов на свету.
Израсходованные растворы и материалы утилизируются в общем порядке как хозяйственно-бытовые отходы.
Инструментарий и оборудование промывается чистой водой, протирается и укладывается обратно в упаковочную коробку тест-системы.
Тест-систему следует хранить в упаковочной коробке в прохладном месте. Тест-система особенно эффективно используется при необходимости выполнения большого количества анализов (скрининга) в короткое время. Кроме того, она входит в состав комплектуемых ГК «Крисмас» мобильных (передвижных) лабораторий санитарно-пищевого контроля.
ГК «Крисмас» разрабатывает, производит и комплектует мобильные лаборатории на базе различных автомобилей, под конкретные задачи потребителей.
Тест-система «Контроль полноты термической обработки (Пероксидаза-тест)» успешно используется при выполнении проектных и учебно-исследовательских работ в курсах химии, биологии, технологии (Кулинария), факультативно в экологии, а также в специализированных образовательных организациях при изучении методов и средств санитарно-пищевого анализа.
Для консультации и по вопросам приобретения просьба обращаться:
labmebel@christmas-plus.ru
8 (800) 302-92-25 (звонок по РФ бесплатный)
8 (812) 575-54-07, 575-55-43
Подписывайтесь на наш канал в Ютюбе!
Вы всегда будете в курсе наших последних новостей и сможете наглядно познакомиться с нашей продукцией.