мук контроль питательных сред
Мук контроль питательных сред
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Методы контроля бактериологических питательных сред
Дата введения: с момента утверждения
1. Разработаны: Федеральным государственным учреждением науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (С.М.Суханова, Н.Е.Захарова, Э.И.Конду, И.А.Голубенко).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3).
3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 18 января 2008 г.
1. Область применения
1.1. Настоящие методические указания предназначены для работников организаций, осуществляющих:
изготовление и контроль качества бактериологических питательных сред (диагностических, для культивирования, транспортных и др.) и (или) их основ при серийном промышленном выпуске;
конструирование новых питательных сред;
изготовление сред из отдельных компонентов по прописям, а также могут быть использованы:
— при экспертизе НД и
— при проведении внутрилабораторного контроля качества коммерческих питательных сред.
1.2. Настоящие методические указания распространяются на исследования бактериологических питательных сред отечественного и зарубежного производства.
2. Нормативные и методические ссылки
2.1. Государственная Фармакопея СССР XI издания. Вып.1, 2.
2.4. Санитарные правила СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности» /Госкомсанэпиднадзор России. М., 1996.
2.5. Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований: ГОСТ Р 51446-99 (ISO 7218-96).
2.6. Агар микробиологический: ГОСТ 17206-96.
2.7. Методические рекомендации «Определение сроков годности сухих микробиологических сред и питательных основ методом «Ускоренного старения» при повышенной температуре». Махачкала, 1987.
2.8. Водоросли морские, травы морские и продукты их переработки: ГОСТ 26185-84.
2.9. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. М., 1980.
2.10. Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред. М., 1977.
2.11. Методические указания «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»: МУК 4.2.1890-04.
3. Общие положения
3.1. Целью введения настоящих методических указаний является регламентация стандартных методов контроля бактериологических питательных сред.
3.2. Методические указания содержат описание общих методов контроля бактериологических питательных сред. Особенности контроля качества сред, не охватываемые настоящим документом, должны быть описаны в нормативной документации на эти препараты.
4. Термины и определения
4.5. Оценка результатов. Определение положительного или отрицательного результата.
5. Общие указания при оценке качества питательных сред
I. Оценка качества питательных сред и их компонентов проводится с помощью совокупности показателей, выбираемых для контроля среды в соответствии с ее назначением, и включает:*
1. Контроль качества препарата по физико-химическим показателям.
* Используемые в лабораториях коммерческие питательные среды контролируются на предприятиях-изготовителях, поэтому внутрилабораторный контроль их качества проводят только в случаях:
указания на необходимость проведения контроля в приказах Минздрава РФ, инструкции по применению или других документах;
несоответствия клинического диагноза результатам микробиологического исследования в лаборатории;
неудовлетворительного выполнения внешней оценки качества микробиологических исследований;
неудовлетворительного качества среды при использовании в практической работе;
несоответствия величины колоний искомого микроорганизма данному виду бактерий при росте в данной среде;
позднего появления роста культуры в среде, не соответствующего срокам для данного микроорганизма;
отсутствия подавления роста сопутствующей микрофлоры на среде с заявленными ингибирующими свойствами.
Для внутрилабораторного контроля качества коммерческих питательных сред, контроль которых не предусмотрен действующими нормативными документами, необходимо проводить визуальную оценку качества, определять значение рН готовой среды, стерильность каждой приготовленной серии (см. р.7.1.1 «Контроль чистоты розлива»), а также оценивать качество среды с помощью контрольных штаммов.
2. Контроль специфической активности препарата по биологическим показателям.
Перечень показателей, необходимых для контроля основных групп питательных сред, приведен в прилож.1.
Готовую среду засевают культурой (тест-штаммом) того (целевого) микроорганизма, для которого приготовлена среда, и гетерологичных штаммов и визуально (или под малым увеличением микроскопа) изучают характер его роста. Рост микроорганизмов оценивают с помощью количественных (для плотных сред), полуколичественных или качественных методов*.
Для оценки результатов качественным методом определяют наличие и характер роста каждого из тест-штаммов. Рост целевых тест-штаммов должен быть типичным по цвету, размеру и морфологии колоний; рост нецелевых должен частично или полностью подавляться.
Для оценки результатов количественным методом при интерпретации ингибирующих, накопительных или задерживающих рост свойств среды, подсчитывают количество выросших колоний на тестируемой и контрольной (среде выращивания) средах.
Требования к специфической активности зарегистрированных в РФ бактериологических питательных сред и добавок перечислены в прилож.2.
III. Серия среды признается годной только после проведения всех видов контроля.
6. Определение физико-химических показателей
6.1. Общие указания для приготовления реактивов
Концентрация. При указании концентрации растворов в процентах, следует подразумевать весобъемные проценты. Например, для приготовления 10%-го раствора следует брать 10 г вещества на 100 мл готового раствора.
Точная навеска. Взвешивание на аналитических весах с точностью до 0,0002 г. Если не указано «точная навеска», то навеску берут с точностью до 0,01 г.
Оценка результатов. Результаты рассчитывают на основании не менее двух параллельных определений. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое значений результатов двух параллельных измерений. Допустимое отклонение от средней величины не должно превышать 10%.
Реактивы и титрованные растворы. Реактивы и титрованные растворы, приведенные в настоящих МУК, описаны в соответствующих разделах Государственной Фармакопеи СССР XI издания, вып.2, если нет других указаний.
Квалификация реактивов. Для анализа необходимо использовать реактивы квалификации хч и чда.
Хранение реактивов. Растворы реактивов хранят при температуре 18-20 °С в течение 6 мес., если нет изменений их физических свойств или нет других указаний.
Контрольный опыт (контроль на реактивы). Под контрольным опытом подразумевают определение, проводимое с тем же количеством реактивов и в тех же условиях, но без испытуемого препарата, вместо которого используют растворитель.
6.2. Описание препарата
Внешний вид препарата определяют визуально, указывая:
физическое состояние (жидкость, мелкодисперсный порошок, гель);
прозрачность (для препаратов готовых к применению). Препарат может быть либо прозрачным, либо с незначительной опалесценцией, либо мутный);
гигроскопичность (для сухих препаратов);
светочувствительность (при наличии в составе компонентов, разрушающихся на свету.
* При описании цвета оттенок указывают перед основным цветом (например, «желтовато-коричневый»).
6.3. Определение растворимости
Количество препарата (г), необходимое для приготовления конкретной серии питательной среды, должно растворяться при перемешивании и, если необходимо, при кипячении в течение 2-3 мин.
Препарат считают растворившимся, если в растворе при визуальном наблюдении в проходящем свете не обнаруживаются частицы вещества.
Для препаратов, образующих при растворении мутные растворы, соответствующее указание должно быть приведено в нормативной документации и инструкции по применению.
1. Область применения
1.1. Настоящие методические указания предназначены для работников организаций, осуществляющих:
— изготовление и контроль качества бактериологических питательных сред (диагностических, для культивирования, транспортных и др.) и (или) их основ при серийном промышленном выпуске;
— конструирование новых питательных сред;
— изготовление сред из отдельных компонентов по прописям, а также могут быть использованы:
— при экспертизе НД и
— при проведении внутрилабораторного контроля качества коммерческих питательных сред.
1.2. Настоящие методические указания распространяются на исследования бактериологических питательных сред отечественного и зарубежного производства.
2. Нормативные и методические ссылки
2.1. Государственная Фармакопея СССР XI издания. Вып. 1, 2.
2.2. Методические указания по методам контроля МУК 4.1/4.2.588-96 «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям» /Минздрав России. М., 1998.
2.3. Санитарные правила СП 3.3.2.561-96 «Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов» /Минздрав России. М., 1998.
2.5. Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований: ГОСТ Р 51446-99 (ISO 7218-96).
2.6. Агар микробиологический: ГОСТ 17206-96.
2.7. Методические рекомендации «Определение сроков годности сухих микробиологических сред и питательных основ методом «Ускоренного старения» при повышенной температуре». Махачкала, 1987.
2.8. Водоросли морские, травы морские и продукты их переработки: ГОСТ 26185-84.
2.9. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. М., 1980.
2.10. Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред. М., 1977.
2.11. Методические указания «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»: МУК 4.2.1890-04.
3. Общие положения
3.1. Целью введения настоящих методических указаний является регламентация стандартных методов контроля бактериологических питательных сред.
3.2. Методические указания содержат описание общих методов контроля бактериологических питательных сред. Особенности контроля качества сред, не охватываемые настоящим документом, должны быть описаны в нормативной документации на эти препараты.
4. Термины и определения
4.5. Оценка результатов. Определение положительного или отрицательного результата.
5. Общие указания при оценке качества питательных сред
I. Оценка качества питательных сред и их компонентов проводится с помощью совокупности показателей, выбираемых для контроля среды в соответствии с ее назначением и включает:*
*Используемые в лабораториях коммерческие питательные среды контролируются на предприятиях-изготовителях, поэтому внутрилабораторный контроль их качества проводят только в случаях:
— указания на необходимость проведения контроля в приказах Минздрава РФ, инструкции по применению или других документах;
— несоответствия клинического диагноза результатам микробиологического исследования в лаборатории;
— неудовлетворительного выполнения внешней оценки качества микробиологических исследований;
— неудовлетворительного качества среды при использовании в практической работе;
— несоответствия величины колоний искомого микроорганизма данному виду бактерий при росте в данной среде;
— позднего появления роста культуры в среде, не соответствующего срокам для данного микроорганизма;
— отсутствия подавления роста сопутствующей микрофлоры на среде с заявленными ингибирующими свойствами.
Для внутрилабораторного контроля качества коммерческих питательных сред, контроль которых не предусмотрен действующими нормативными документами, необходимо проводить визуальную оценку качества, определять значение pH готовой среды, стерильность каждой приготовленной серии (см. р. 7.1.1 «Контроль чистоты розлива»), а также оценивать качество среды с помощью контрольных штаммов.
1. Контроль качества препарата по физико-химическим показателям.
2. Контроль специфической активности препарата по биологическим показателям.
Перечень показателей, необходимых для контроля основных групп питательных сред, приведен в прилож. 1.
Готовую среду засевают культурой (тест-штаммом) того (целевого) микроорганизма, для которого приготовлена среда, и гетерологичных штаммов и визуально (или под малым увеличением микроскопа) изучают характер его роста. Рост микроорганизмов оценивают с помощью количественных (для плотных сред), полуколичественных или качественных методов*.
Для оценки результатов качественным методом определяют наличие и характер роста каждого из тест-штаммов. Рост целевых тест-штаммов должен быть типичным по цвету, размеру и морфологии колоний; рост нецелевых должен частично или полностью подавляться.
Для оценки результатов количественным методом при интерпретации ингибирующих, накопительных или задерживающих рост свойств среды, подсчитывают количество выросших колоний на тестируемой и контрольной (среде выращивания) средах.
Требования к специфической активности зарегистрированных в РФ бактериологических питательных сред и добавок перечислены в прилож. 2.
III. Серия среды признается годной только после проведения всех видов контроля.
6. Определение физико-химических показателей
6.1. Общие указания для приготовления реактивов
Концентрация. При указании концентрации растворов в процентах, следует подразумевать весобъемные проценты. Например, для приготовления 10 %-го раствора следует брать 10 г вещества на 100 мл готового раствора.
Точная навеска. Взвешивание на аналитических весах с точностью до 0,0002 г. Если не указано «точная навеска», то навеску берут с точностью до 0,01 г.
Оценка результатов. Результаты рассчитывают на основании не менее двух параллельных определений. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое значений результатов двух параллельных измерений. Допустимое отклонение от средней величины не должно превышать 10%.
Реактивы и титрованные растворы. Реактивы и титрованные растворы, приведенные в настоящих МУК, описаны в соответствующих разделах Государственной Фармакопеи СССР XI издания, вып. 2, если нет других указаний.
Квалификация реактивов. Для анализа необходимо использовать реактивы квалификации хч и чда.
Контрольный опыт (контроль на реактивы). Под контрольным опытом подразумевают определение, проводимое с тем же количеством реактивов и в тех же условиях, но без испытуемого препарата, вместо которого используют растворитель.
6.2. Описание препарата
Внешний вид препарата определяют визуально, указывая:
— физическое состояние (жидкость, мелкодисперсный порошок, гель);
— прозрачность (для препаратов готовых к применению). Препарат может быть либо прозрачным, либо с незначительной опалесценцией, либо мутный);
— гигроскопичность (для сухих препаратов);
— светочувствительность (при наличии в составе компонентов, разрушающихся на свету.
*При описании цвета оттенок указывают перед основным цветом (например, «желтовато-коричневый»).
6.3. Определение растворимости
Препарат считают растворившимся, если в растворе при визуальном наблюдении в проходящем свете не обнаруживаются частицы вещества.
Для препаратов, образующих при растворении мутные растворы, соответствующее указание должно быть приведено в нормативной документации и инструкции по применению.
6.4. Определение прозрачности и цветности
Прозрачность и цветность сухих препаратов определяется визуально в проходящем свете в растворе после фильтрации его через ватно-марлевый фильтр (агаровые среды) и бумажный фильтр (жидкости) (подготовку образца см. раздел 6.3 «Определение растворимости») (см. примечание раздела «Описание препарата»).
Раствор препарата, а также готовая среда могут быть либо прозрачными, либо с незначительной опалесценцией, либо непрозрачными.
После приготовления среды из сухого препарата (стерилизации, розлива в чашки Петри, пробирки и подсушивания) показатель прозрачности и цветности указывается также и для готовой среды.
6.5. Определение pH
Определение pH питательных сред проводят потенциометрическим методом с применением стеклянного электрода.
Калибровка и проверка pH-метра (потенциометра). Подготовка pH-метра и электродной системы производится согласно инструкциям, прилагаемым к прибору. Перед работой на потенциометре необходимо, пользуясь стандартными буферными растворами со значениями pH 4,01; 6,86; 9,18 при 25 °С, провести калибровку прибора*. Для приготовления таких растворов могут быть использованы фиксаналы (ГОСТ 8-135- 74). Различие между показанием прибора и номинальным значением pH буферного раствора не должно превышать 0,04 единицы pH.
Если pH контролируемого раствора отличается менее чем на единицу от pH стандартного буферного раствора, то достаточна проверка прибора по одному буферному раствору, величина pH которого лежит в том же диапазоне измерения, что и значения pH контролируемого раствора. Если pH контролируемых растворов находятся в широких пределах, то проверку pH-метра следует производить по двум (трем) стандартным буферным растворам в соответствии с инструкцией.
При измерении pH контролируемых растворов отсчет величины pH по шкале прибора производят после того, как показания прибора примут установившееся значение. Время установления показаний определяется буферными свойствами и температурой раствора (обычно время установления показаний не превышает 2 мин). Определение pH проводят при (25 ± 2) °С, в противном случае необходимо сделать соответствующие поправки (подвести ручку термокомпенсатора либо использовать коэффициент пересчета). При измерении pH агаровых сред следует иметь ввиду, что полученные значения pH являются условными.
Оценку значения pH питательных сред необходимо проводить с учетом последующей стерилизации.
Примечание : автоклавирование, как правило, приводит к снижению pH, поэтому перед стерилизацией pH среды повышают на 0,2 единицы от требуемой величины, а после автоклавирования реакцию среды проверяют повторно.
Метод измерения pH
— в готовых жидких средах и гидролизатах определение pH проводят непосредственно в растворе;
— для сухих препаратов, не содержащих агар, определение pH проводят в 2 %-м растворе, приготовленном добавлением к 2,00 г сухого препарата 100 мл дистиллированной воды, перемешиванием и последующим фильтрованием через бумажный фильтр;
6.6. Определение белка
Реактивы: 20 %-я трихлоруксусная кислота.
К 5 мл 5 %-го раствора анализируемого препарата добавляют равный объем 20 %-й ССl3СООН, тщательно перемешивают.
Помутнение раствора через 5 мин свидетельствует о присутствии в препарате следов белка.
6.7. Определение содержания пептидов по биуретовой реакции
Метод основан на способности пептидов давать цветную реакцию с биуретовым реактивом. Концентрацию пептидов («пептонов») определяют путем сравнения интенсивности окраски испытуемого и стандартного растворов.
Приготовление реактива А. Растворяют 1 г меди сульфата (CuSO4 ⋅ 5Н2O) в нескольких миллилитрах воды. В этот раствор прибавляют 4,5 г натрия-калия тартрата, предварительно растворенного в 40 мл воды. Объем раствора доводят водой до 50 мл. Раствор годен к употреблению в течение дня.
2) 10 %-й раствор натрия едкого;
3) 0,9 %-й раствор натрия хлорида;
4) 1 %-й стандартный раствор пептона (ГОСТ 13805-76).
Приготовление 1 %-го стандартного раствора пептона. Стандартный раствор 1 %-го пептона готовят с учетом влажности при растворении навески в 0,9 %-м растворе натрия хлорида. Реактив хранят в холодильнике. В качестве консерванта используют мертиолят (1:10 000).
Приготовление контрольного раствора. К 5 мл 0,9 %-го раствора натрия хлорида добавляют 0,5 мл 10 %-го раствора натрия едкого и 0,5 мл реактива А.
Построение калибровочной кривой. Из стандартного раствора готовят ряд разведений с содержанием пептона от 0,1 до 0,5 % на 0,9 %-м растворе натрия хлорида с интервалом 0,1%. К 5 мл каждого разведения прибавляют 0,5 мл 10 %-го раствора натрия едкого и 0,5 мл реактива А.
Пробы колориметрируют сразу после внесения реактивов на фотоэлектроколориметре (ФЭК) при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 5 мм против контрольного раствора. По показаниям прибора строят кривую зависимости оптической плотности от концентрации пептона. Калибровочную кривую проверяют перед каждым определением.
Подготовка проб. Для анализа используют гидролизаты и питательные среды, разведенные в 10 раз 0,9 %-м раствором натрия хлорида.
К 5 мл испытуемого раствора добавляют 0,5 мл 10 %-го раствора едкого натрия и 0,5 мл реактива А.
Одновременно готовят контрольную пробу и проводят определение, как описано при построении калибровочной кривой. Концентрацию пептона в испытуемом растворе в процентах вычисляют по калибровочной кривой и производят перерасчет с учетом разведения.*
*Методика может быть рекомендована для гидролизатов и питательных сред с определенной цветностью. Показатель оптической плотности среды не должен превышать 0,2 при определении на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 5 мм против воды.
6.8. Определение общего азота с реактивом Несслера
Реактивы: 1) серная кислота концентрированная;
3) реактив Несслера (готовый);
4) раствор аммония серно-кислого, содержащий 0,05 мг/мл азота.
400 нм) в кюветах с толщиной слоя 10 мм.
Раствором сравнения служит контрольная проба, содержащая 0,5 мл реактива Несслера в 9,5 мл воды. По показаниям прибора строят кривую зависимости оптической плотности от концентрации азота. Калибровочный график воспроизводят при каждом определении.
Жидкий гидролизат следует развести в 100 раз.
400 нм) в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Раствором сравнения служит раствор, приготовленный аналогично образцу.
Содержание общего азота в препарате в процентах (X) вычисляют по формуле:
Для сухого образца (сухой гидролизат, сухая питательная среда)
Для жидкого образца (жидкий гидролизат):
6.9. Определение содержания аминного азота
формольным титрованием
Определение содержания аминного азота в питательных средах проводят методом формольного титрования. Принцип метода основан на блокировании формальдегидом при pH 7,0 свободных аминогрупп и титровании щелочью эквивалентного количества карбоксильных групп. Начало и конец титрования определяют потенциометрически.
Реактивы: 1) натрия гидроксид (0,1 моль/л) или раствор соляной кислоты (0,1 моль/л);
2) натрия гидроксид 10 %-й раствор;
К нейтрализованному раствору добавляют 2 мл нейтрального формалина, перемешивают и, не вынимая электроды, титруют содержимое раствором натрия гидроксида (0,1 моль/л) до pH 9,1***. Проводят два параллельных измерения.
*Перед каждым определением pH формалина доводят до pH 7,0 10 %-м раствором натрия гидроксида.
**В ходе определения электроды должны все время оставаться погруженными в раствор.
***При титровании следует использовать бюретку, вместимостью 5 мл.
Содержание аминного азота в исследуемом препарате в процентах (X) вычисляют по следующим формулам.
Для сухого образца:
1,0 мл р-ра натрия гидроксида (0,1 моль/л);
Для жидкого образца:
— для готовых плотных агаровых сред «А» = 3 мл препарата, расплавленного в кипящей водяной бане.
6.10. Определение содержания хлоридов аргентометрическим
методом (в пересчете на натрия хлорид)
Метод основан на определении ионов хлора после окисления белков перманганатом калия в кислой среде в присутствии нитрата серебра, избыток которого оттитровывают раствором роданида аммония.
2) кислота азотная концентрированная;
*Ex tempore готовят 0,01 моль/л раствор разведением 0,1 моль/л раствора (1:10).
6) железоаммиачные квасцы, насыщенный раствор (к 40 %-му р-ру на холоде прибавляют по каплям концентрированную азотную кислоту до перехода коричневой окраски в желтовато-зеленую. Хранить в защищенном от света месте.
Для анализа используют объем «В, мл» жидкого образца.
40 % р-р), определяя объем, пошедший на титрование.
Содержание натрия хлорида в жидких препаратах в процентах (X) вычисляют по формуле:
Содержание натрия хлорида в сухих препаратах в процентах (X) вычисляют по формуле:
Остальные обозначения см. выше.
6.11. Определение потери в массе при высушивании
Расчет массовой доли влаги в процентах проводят по разности масс до и после высушивания.
6.12. Определение сухого остатка
Принцип метода основан на удалении влаги путем выпаривания исследуемого раствора и последующем высушивании остатка до постоянного веса.
Подготовка проб. Для анализа отбирается 1 мл исследуемого образца.
Анализ проводят во взвешенной и доведенной до постоянной массы фарфоровой чашке (d = 7 см), куда наливают 1 мл исследуемого образца и выпаривают его на кипящей водяной бане (при постоянном помешивании препаратов, содержащих агар). После испарения жидкости чашку ставят в сушильный шкаф (100 ± 5) °С на 2 ч, охлаждают в эксикаторе и взвешивают на аналитических весах.
Содержание сухого остатка (%) рассчитывают по формуле:
6.13. Определение стерильности готовых к применению сред
Определение стерильности добавок питательных сред (кровь, сыворотка крови) проводят методом прямого посева.
В случае помутнения питательной среды после внесения в нее испытуемого препарата следует в интервале от 3 до 7 сут. после посева сделать пересев приблизительно по 0,5 мл на две пробирки, содержащие
10,0 мл тиогликолевой среды. Все пробирки выдерживают после пересева при соответствующих температурах до окончания инкубации (14 сут.) со дня первичного посева.
Среды, приготавливаемые из сухих препаратов и (или) разливаемые в лаборатории в чашки (пробирки), контролируют на чистоту розлива (см. «Подготовка образцов питательных сред для контроля. Контроль чистоты розлива»),
6.14. Определение прочности студня агаровых сред по Валенту
Прочность студня среды. Сущность метода заключается в определении массы нагрузки, необходимой для разрушения структуры образца. Определение проводят с помощью прибора Валента (рис. 1).
— в приборе Валента проверяются: линии отвеса и устойчивость прибора на всех регулировочных ножках. В сборник при помощи воронки насыпается песок, на шпильку нажимного штока надевается приёмник песка.
— песок, применяемый в приборе, приготавливается из кварцевого путем промывки его разбавленной соляной кислотой (12 ч), водой, высушивания и отсева на почвенных ситах. Для работы используется фракция с диаметром частиц более 0,5 мм.
Для готовых препаратов. Готовую агаровую среду выдерживают в кипящей водяной бане до полного расплавления студня осторожно помешивая круговыми движениями, и немедленно разливают в 3 сборных цилиндра по 30 мл.
Для сухих препаратов. Для приготовления образца студня к навеске агаровой среды по прописи* (с точностью до 0,01 г) в сухой конической или плоскодонной колбе порциями при энергичном взбалтывании прибавляют 100 мл дистиллированной воды, смывая частицы препарата со стенок колбы. Колбу закрывают ватной пробкой и при осторожном нагревании жидкость доводят до кипения. Операцию повторяют 3 раза (до 3-кратного вспенивания). Признаком растворения будет появление крупно-пузырчатой пены; 100 мл полученного горячего раствора агаровой среды (не ниже 80 °С) немедленно разливают в 3 сборные цилиндра по 30 мл.
Цилиндрики с горячей средой ставят в горизонтально установленный сосуд с плоским дном, наполненный водой, уровень которой немного ниже уровня раствора в цилиндриках, и выдерживают 20 мин при 20 °С, поддерживая температуру добавлением в сосуд при перемешивании холодной или теплой воды. Через 20 мин цилиндрики с образовавшимся студнем вынимают и, держа их наклонно (верхним краем к листу бумаги), отвинчивают дно. Нажимом вбок сдвигают вкладной диск и, увеличивая величину наклона, дают столбику студня выскользнуть на фильтровальную бумагу*. После чего его переносят на основание прибора Валента, установленного с помощью уровня.
*Поверхность столбика студня оберегать от повреждения!
Левой рукой поднимают нажимной шток прибора с насадкой над серединой столбика студня, который, в свою очередь, подводят правой рукой. Затем одновременно, осторожно опуская левой рукой шток на столбик студня, правой натягивают до отказа кольцо шнура перекрывающего механизма и насыпают песок в приемник до тех пор, пока насадка не начнет разрушать столбик студня.
Как только насадка прорвет пленку столбика студня, немедленно отпускают кольцо шнура. Снимают приёмник песка и взвешивают его с точностью до 1,0 г. Полученная сумма масс песка с приемником и штока с насадкой и будет выражать прочность исследуемого препарата по Валенту в граммах.
За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое значений результатов трех параллельных измерений. Допустимое отклонение измерений от средней величины не должно превышать 10 %.
6.15. Определение температуры застудневания
Метод основан на визуальном определении момента застудневания раствора агара.
Подготовка проб. Навеска препарата из расчета приготовления 150 мл среды растворяется при кипячении.
Во флакон со 150 мл раствора питательной среды (приготовленной в концентрации, указанной на этикетке флакона с сухой средой), погружают термометр, по которому фиксируют температуру перехода содержимого флакона в студень.
Температура застудневания для плотной агаризованной среды должна быть не ниже 30 и не выше 37 °С.
6.16. Определение температуры плавления студня среды
Метод основан на визуальном определении точки плавления агарового студня.
Подготовка проб. Для определения температуры плавления плотных питательных сред используют раствор среды, приготовленный для определения температуры застудневания.
Две пробирки (ГОСТ 25336-82Е) объёмом 20 мл заполняют приблизительно до половины их высоты раствором среды и закрывают заранее подобранными резиновыми пробками. Для застудневания раствора пробирки оставляют при температуре около 20 °С не менее, чем на 3 ч, после чего пробирки со студнем помещают в стакан с водой, имеющей температуру 60 °С, заменяя пробки на ватно-марлевые. Стакан с пробирками и термометром, опущенным в пробирку с водой, помещают в баню (60 °С), которую нагревают таким образом, чтобы скорость повышения температуры воды в стакане не превышала 0,5 °С в минуту.
Через каждый градус повышения температуры одну из пробирок вынимают из стакана и, наклонив ее, наблюдают, не расплавился ли студень. Температуру, при которой содержимое пробирки полностью перейдет в жидкое состояние, отмечают как температуру плавления среды. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, допустимые расхождения между которыми не должны превышать 1 °С.
Температура плавления плотной агаризованной среды не должна быть ниже 80 °С.
6.17. Определение продолжительности плавления студня среды
Полное расплавление студня учитывают визуально.
Две бутылки с готовым препаратом выдерживают в кипящей водяной бане, периодически осторожно перемешивая содержимое. Показатель определяют от момента закипания воды до полного расплавления агара. Среда во флаконах (бутылках) должна выглядеть однородной, жидкой, без сгустков агара.
Продолжительность плавления студня среды должна быть не более 1 ч.
6.18. Определение срока годности
Для определения сроков годности питательных сред можно использовать метод выемок проб, а для сухих питательных сред также метод «ускоренного старения».
*Проводится не менее 5 измерений («выемок») по всем показателям качества.
Срок годности среды вычисляется как время хранения препарата, при котором все показатели его качества не изменяются или находятся в пределах допустимых значений, минус 3 месяца.
Для сокращения времени изучения стабильности свойств сухих питательных сред может быть использован метод «ускоренного старения».
Метод «ускоренного старения» используют для определения сроков годности сухих микробиологических сред и питательных основ, в составе которых могут быть как синтетические ингредиенты, так и компоненты, получаемые из природного сырья (белковые основы, витамины, аминокислоты, агары и т.д.).
Данный метод заключается в выдерживании испытуемой среды (питательной основы) при температурах, превышающих среднюю температуру хранения, для ускорения протекающих в них физико-химических процессов. По результатам, полученным методом «ускоренного старения», можно установить температуру хранения, обеспечивающую заданный срок годности. Пересчет срока экспериментального хранения (годности) на срок хранения (годности) при стандартных условиях (давление 101,325 кПа, температура 20 °С, относительная влажность воздуха 60 %) проводят по следующему уравнению:
tэ — температура экспериментального хранения;
7. Оценка специфической активности питательных сред
по биологическим показателям
Набор показателей, необходимых для определения специфической активности каждой среды, определяется ее назначением (см. прилож. 1).
7.1 Подготовка образцов питательных сред для контроля
Готовые к применению среды. Работа должна быть проведена с соблюдением правил асептики. Перед использованием снять алюминиевый колпачок с бутылки, заменить резиновую пробку на стерильную ватно-марлевую.
— Жидкую среду разлить в стерильные пробирки*.
Сухие среды. Готовят в соответствии с инструкцией по применению среды. При необходимости стерилизуют автоклавированием**.
*Объем среды, разливаемой в пробирки, указывается в инструкции по применению обычно составляет:
**Некоторые селективные бульоны (среды Кода, Лейфсона, SDS-бульон) не стерилизуют, а лишь доводят до кипения.
Бульоны фильтруют через бумажный фильтр и разливают в стерильные пробирки.
Агаровые среды фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в стерильные пробирки, флаконы и другие емкости.
Режимы стерилизации сред
121 °С в течение 15 мин
Тиогликолевая среда, МПА, МПБ, бульон Хоттингера, агар Хотгингера, СПА, СПБ
120 °С в течение 30 мин
112 °С в течение 20 мин
Среды, содержащие углеводы (среды Гисса), витамины, молоко, желатин
110 °С в течение 30 мин
100 °С в течение 15 мин
7.1.1. Контроль чистоты розлива
7.1.2. Хранение приготовленных сред
Определение срока хранения приготовленных сред
Среду готовят к использованию (вносят добавки, разливают в пробирки, чашки Петри и т.д.), помещают в определенные условия (t°, свет) и устанавливают, в течение какого времени и при каких условиях среда сохраняет свой искомый внешний вид (цвет, прозрачность, отсутствие признаков высыхания), pH и специфическую активность.
7.2. Тест-штаммы
Для проведения контроля качества БПС необходимо иметь коллекцию типовых культур, которые могут быть получены из следующих специализированных коллекций:
— Государственная коллекция патогенных микроорганизмов Государственного института стандартизации и контроля (ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора);
— Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ);
— Всесоюзная коллекция непатогенных микроорганизмов (ИБФМ);
— Из международных коллекций:
— Американская коллекция типовых культур (АТСС);
— Английская национальная коллекция типовых культур (NCTC);
— Другие коллекции (см. прилож. 3).
Изоляты микроорганизмов, выделенные из клинического материала и используемые для контроля, должны по свойствам соответствовать микроорганизмам признанных национальных и международных коллекций.
Используемые для контроля БПС тест-штаммы должны быть типичными по культурально-морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам, а также проверяться на отсутствие диссоциации.
Тест-штаммы необходимые для контроля наиболее распространенных питательных сред (см. прилож. 2) могут быть получены из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
7.2.1. Подготовка тест-штаммов для контроля
7.2.1.1. Восстановление культур
Восстановление культур (из лиофилизированного состояния, со среды хранения) проводят с использованием плотной и жидкой* питательных сред, принятых для определенной группы микроорганизмов.
*В случае отсутствия первичного роста культуры на плотной среде необходимые исследования проводят с бульонными культурами.
Микроорганизмы после I пассажа (пересева) обладают пониженной жизнеспособностью, в связи с чем рекомендуется использовать для работы культуру II или III пассажа.
Для большинства микроорганизмов используют сухие питательные среды (СПБ, СПА, ГРМ-бульон, ГРМ-агар) либо готовые к применению коммерческие препараты, имеющие pH 7,2 ± 0,2 (МПА, МПБ, агар и бульон Хотгингера), а также питательные среды лабораторного приготовления:
Питательные среды лабораторного приготовления
вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72
фарш мясной (на 1 пробирку с 10 мл среды)
вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72
Следует иметь в виду, что при использовании недостаточно обезжиренного и высушенного фарша в среде может наблюдаться опалесценция.
пептон сухой ферментативный для бактериологических целей (ГОСТ 13805-76)
цистин (ТУ 6-09-235-80)
Для приготовления печеночного бульона 500 г говяжьей печени кипятят в 1 л дистиллированной воды в течение 2 ч, после фильтрации через марлевый фильтр количество отвара доводят до 1 л дистиллированной водой.
Лиофилизированные культуры из ампул или со среды хранения пересевают:
Выросшую на питательном агаре культуру каждого тест-штамма проверяют визуально на чистоту роста (отсутствие колоний других микроорганизмов) и отсутствие диссоциации. В случае необходимости проводят изучение культурально-морфологических и биохимических свойств. Тест-штаммы должны находиться в типичной для данного микроорганизма форме. При обнаружении более 25 % полиморфных колоний культура не может быть использована для контроля БПС.
Лиофилизированную культуру из ампул или со среды хранения, пересевают в пробирки (посевной материал вносят в нижнюю часть пробирки) с предварительно регенерированной** средой Тароцци и осторожно перемешивают***.
*Возможно предварительное подращивание культуры в питательном бульоне в течение (4,0 ± 0,5) ч до посева на питательный агар.
***При работе с анаэробной культурой перемешивание осуществляют с помощью пипетки; во избежание аэрации пипетку не вынимают из жидкости и содержимое из пипетки не выдувают до конца.
*****Рост должен отсутствовать.
7.2.1.2. Контроль тест-штаммов на отсутствие диссоциации
Проверка тест-штаммов на отсутствие диссоциации проводится по
а) визуальный просмотр колоний на чашках и под микроскопом в «проходящем» свете;
б) проба кипячением 2 млрд микробных клеток (выращенных на плотной среде) в физиологическом растворе на водяной бане в течение 1 ч. Взвесь должна быть гомогенной;
в) эмульгирование культуры на стекле в 0,9 и в 4,0 %-м растворах NaCl, а также в растворе трипофлавина 1:1000 (для культур, не содержащих поверхностных К-антигенов). Культура не должна образовывать хлопьевидный осадок.
г) реакция агглютинации специфическими сыворотками или в развернутой реакции агглютинации с неадсорбированными сыворотками. Реакция агглютинации должна быть не менее, чем на 3+ при отрицательном контроле в растворе натрия хлорида.
7.2.1.3. Приготовление рабочей культуры и посев
*Отраслевой стандартный образец мутности (ОСО-42-28-85 П) выпускается ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича для визуального определения мутности бактерийных взвесей методом сравнения. Мутность стандарта, равная 10 единицам мутности, эквивалентна 10 международным единицам мутности, которые ориентировочно соответствуют следующим концентрациям клеток в 1 мл:
0,93×10 9 клеток/мл для микробов кишечной группы;
11,0×10 9 клеток/мл для микробов коклюшной группы;
1,7×10 9 клеток/мл для микробов бруцеллезной группы;
2,2×10 9 клеток/мл для холерного вибриона;
5,0×10 9 клеток/мл для туляремийных микробов.
В процессе разведения перенос взвеси в следующую пробирку производят со сменой стерильной пипетки вместимостью 1 мл (ГОСТ 29227-91) (2 класс точности).
В пробирки с бульоном культуру вносят стерильной пипеткой, с последующим перемешиванием содержимого в закрытой пробирке*.
В пробирки с полужидким агаром культуру вносят стерильной пипеткой в столбик среды без дальнейшего перемешивания.
В пробирки с плотным агаром культуру вносят бактериологической петлей уколом в столбик среды, не доводя до дна пробирки, или штрихом на поверхность, микробную взвесь в пробирках со скошенным агаром распределяют путем обкатывания.
Посевы помещают в соответствующие условия инкубации.
Температура**, время*** и другие условия инкубации определяются потребностями тест-штаммов, необходимыми для их оптимального роста, а также особенностями питательной среды.
*При посеве анаэробов избегать интенсивной аэрации.
***Минимальное время инкубации, достаточное для выявления микроорганизмов (выражается в часах) после посева культур.
При необходимости восстановленную культуру пересевают на среду хранения.
Среды хранения
Для большинства аэробов
гидролизат казеина панкреатический
натрия хлорид 5,0 г
вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72
*Варьирование величины связано с различной прочностью студня агара. Прочность студня готовой среды должна быть (175 ± 18) г
Разлить по 5 мл в пробирки, стерилизовать автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин или 2. Питательная среда следующего состава:
питательный бульон, сухой (СПБ)
или ГРМ-бульон сухой
Разлить по 5 мл в пробирки, стерилизовать автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин.
Для энтерококков, стрептококков, коринебактерий
с добавлением 12,5 % нормальной лошадиной сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота.
Разлить по 10 мл в пробирки, стерилизовать автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин.
или 2. МПА 0,1 %-й полужидкий, pH 7,6 ± 0,1;
или 3. Сывороточный агар (питательный агар содержащий 10 % лошадиной сыворотки или СКРС) pH 7,6 ± 0,1;
Среда для получения спор («споровая» среда):
гидролизат казеина неглубокой степени расщепления ферментативный сухой
казеин хлоркальциевый (на 1 пробирку с 10 мл среды)
вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72
Разлить по 10 мл в пробирки, стерилизовать автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин.
Культуру аэробов, прошедшую 2 пассажа (см. «Восстановление культур»), снимают бактериологической петлей. Затем уколом петли ее вносят в столбик агаровой среды хранения.
При недостаточном количестве посевного материала (энтерококки, стрептококки, коринебактерии) бульонную культуру пастеровской пипеткой можно засеять на среду Мартена.
Посевы инкубируют в течение 24 ч при температуре (37 ± 1) °С. Пересевы со среды хранения на питательный бульон, питательный агар и вновь на среду хранения проводят через каждые 3 мес., но не более 4 раз.
Состав раствора для разведения культуры («разводящая» жидкость) : натрия хлорид 8,5 г
кислота тиогликолевая 0,3 мл
вода дистиллированная 1 л pH 7,2 ± 0,2
Раствор стерилизуют при 121 °С 15 мин. Использовать раствор можно в течение 7 дней со дня приготовления. При хранении раствора более суток перед посевом его необходимо регенерировать выдерживанием флаконов в кипящей водяной бане 15 мин и последующим быстрым охлаждением в воде.
Для хранения отбирают пробирки, содержащие не менее 5 % спор**. Пробирки накрывают полиэтиленовой пленкой и хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 6 месяцев в условиях, предохраняющих культуру от высыхания. Используют по мере необходимости.
Из одной ампулы лиофилизированной культуры допускается не более трех последовательных пересевов на споровую среду хранения с промежуточными пассажами на среде Тароцци.
7.3. Определение показателя стабильности основных
биологических свойств микроорганизмов
г) биохимические свойства (ферментация углеводов, образование H2S, индола, токсинообразование, гемолиз и др.), пигментообразование;
Данные свойства определяют по общепринятым методикам. По п.п. в), г), д) изучают не менее, чем 3 колонии с каждой чашки.
7.4. Определение показателей чувствительности среды и
скорости роста микроорганизмов
По 0,1 мл микробной суспензии из каждого разведения (см. раздел «Приготовление рабочей культуры и посев») высевают на 3 подсушенные чашки Петри (или пробирки) с плотной средой или в 3 пробирки с 10 мл жидкой (полужидкой) питательной среды**.
*О наличии роста микроорганизма Судет как по формированию видимых колоний, так и по изменениям самой среды (помутнение, газообразование, появление осадка, пленки, изменение цвета).
**При посеве в жидкие (полужидкие) питательные среды обогащения посевная доза может составлять 0,5 или 1,0 мл микробной взвеси в каждую пробирку с 9,5 или 9,0 мл среды соответственно.
Посевы помещают в соответствующие условия.
После инкубации производят учет результатов.
Скорость роста (ч) определяют по минимальному времени инкубации посевов, за которое при соответствующем разведении обеспечивается отчетливый (не менее 100 жизнеспособных клеток) видимый невооруженным глазом рост культуры (помутнение, наличие пленки, осадка, роста по уклону и др.) во всех засеянных пробирках с жидкими (полужидкими) питательными средами или формирование типичных, легко дифференцируемых колоний на чашках (пробирках) с плотной средой.
7.5. Определение дифференцирующих свойств среды
Дифференцирующие свойства сред для выделения микроорганизмов определяют по следующим тестам:
б) четкость дифференциации колоний группы патогенных микроорганизмов от непатогенных, входящих в тот же систематический таксон, и от естественных ассоциантов при посеве смесей.
Для оценки дифференцирующих свойств среды готовят смесь из штамма возбудителя и непатогенного штамма (или ассоцианта). Испытывают два варианта смесей патогенного и непатогенного штаммов в количественном соотношении микробных клеток 1:1 (для учета четкости дифференциации) и 1:10 (для оценки возможности выделения единичных патогенных возбудителей из смеси с другими микроорганизмами) (рекомендуемые разведения см. прилож. 2). Высев из каждой смеси производят по 0,1 мл на 3 чашки с опытной средой.
Дифференцирующие свойства сред для идентификации чистых культур определяют качественно, используя набор штаммов с положительными и отрицательными признаками по соответствующим тестам.
Посев производят по одной бактериологической петле (d = 2 мм) культуры каждого тест-штамма или взвеси каждого тест-штамма, соответствующей 10 ед. мутности ОСО, в 3 пробирки с питательной средой.
Посев в пробирки с плотной средой осуществляют уколом в столбик и штрихом по скошенной части.
7.6. Определение ингибирующих свойств среды
Показатель ингибирующих свойств выражают как:
— минимальное разведение культуры, при посеве из которого полностью отсутствует рост и (или) проявление типичных свойств посторонней микрофлоры на испытуемой среде при его наличии на среде выращивания (ингибирующие свойства);
— величину отношения среднего числа сформировавшихся колоний тест-штамма на «неингибиторной» среде (среда выращивания) к среднему числу колоний на испытуемой «ингибиторной» среде (показатель ингибиции) с учетом разведения.
Ингибирующее действие плотных сред в отношении микробов-ассоциантов определяют путем посева по 0,1 мл микробной взвеси из соответствующего разведения* культуры на 3 чашки с испытуемой средой и на 3 чашки со средой выращивания используемого штамма.
*Выбор разведения культуры зависит от штамма и степени ингибиции конкретной среды.
Ингибирующее действие жидких (полужидких) селективных (элективных) питательных сред определяют, используя монокультуры и смеси. Оценку действия таких сред проводят в сравнении с «нулевым» посевом, т.е. посевом из контролируемой среды без соответствующей инкубации на среду выращивания.
**При посеве в жидкие (полужидкие) питательные среды посевная доза может составлять 0,5 или 1,0 мл микробной взвеси в каждую пробирку с 9,5 или 9,0 мл среды соответственно.
2. Посевы (и в чашках, и в пробирках) инкубируют при соответствующих условиях в зависимости от назначения среды, после чего содержимое каждой из 3-х засеянных пробирок с жидкой (полужидкой) средой перемешивают и повторно высевают по 0,1 мл на 3 чашки с плотной питательной средой. Посевы инкубируют в тех же условиях.
Показатель ингибиции для жидких (полужидких) селективных сред выражают отношением среднего числа колоний, образовавшихся на плотной среде при «нулевом посеве», к среднему числу колоний на той же среде после инкубирования посевного материала в жидкой (полужидкой) питательной среде.
7.7. Определение эффективности среды
Оценку качества накопительных питательных сред по показателю эффективности производят путем определения концентрации микробных клеток в среде после соответствующей инкубации.
Смывают культуру с 5 мл питательного агара 2,5 мл 0,9 %-го раствора хлорида натрия, т.е. на 1 мл питательного агара приходится 0,5 мл взвеси культуры. Для разведения 0,5 мл взвеси культуры до содержания 1 млрд микробных тел (10 ед. по стандарту мутности) пошло 3,5 мл 0,9 %-го раствора хлорида натрия. Следовательно, в пробирке будет содержаться 3,5 мл 0,9 %-го раствора хлорида натрия плюс 0,5 взвеси культуры, т.е. всего 4,0 мл микробной взвеси с концентрацией 1 млрд м.к./мл, степень разведения составляет 8 ( 4,0 /0,5), а выход микробных клеток с 1 мл среды составит соответственно 8 млрд. Показатель эффективности составит 800 (5×8 млрд/50 млн).
*Выбор разведения для конкретного штамма определяется возможностью подсчета колоний до и после накопления культуры в среде.
Содержимое пробирок перемешивают и из каждой пробирки производят высев по 0,1 мл взвеси культуры на 3 чашки с питательной средой, оптимальной для данного микроорганизма («нулевой посев»).
Прирост числа микроорганизмов в накопительной среде в процессе инкубации посевов в течение соответствующего времени (t) определяют по формуле (%):
7.8. Определение показателя прорастания микроорганизмов
Данный показатель определяют для плотных питательных сред.
Подготовку тест-штаммов для контроля, их посев в среду осуществляют по аналогии с методикой определения показателей чувствительности и скорости роста. Посев осуществляют параллельно на испытуемую и контрольную среду*, как правило из 2-х разведений, обеспечивающих формирование на чашке Петри не менее 25 и не более 150 колоний.
*В качестве контрольной может быть использована среда, на которой формируется максимальное число колоний из числа засеянных, а также ранее отконтролированная по всем показателям среда с требуемыми свойствами.
Показатель прорастания микробных клеток определяют как отношение среднего числа колоний, образовавшихся на испытуемой среде, к среднему числу колоний на контрольной среде, выраженное в процентах.
7.9. Определение нейтрализующих свойств среды
7.10. Определение показателя чувствительности микроорганизмов
к антимикробным препаратам диск-диффузионным методом
Данный показатель определяют для сред специального назначения, используемых для выявления чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (АМП), нанесенным на диски. Их наименование и концентрация определяется для конкретной среды.
При измерении зон задержки роста учитывают диаметр только зоны просветления.
Поскольку действие АМП зависит от скорости их диффузии в агаровую среду, а также антагонистического воздействия на них компонентов питательной среды, в частности, тимина и тимидина (ингибиторы сульфаниламидов и триметоприма) и катионов Са 2+ и Mg 2+ (ингибиторы аминогдикозидов, фторхинололов, карбапенемов, тетрациклинов и др.), то среды необходимо стандартизовать по этим показателям.
Контроль содержания тимина и тимидина
Среднее количество колоний, выросших на среде выращивания при «нулевом» посеве и после 24 ч выдерживания в транспортной среде, не должно различаться более чем в 10 раз.