произвести посев вареного мяса по шукевичу на скошенный агар
Животноводство
Выращивание домашних животных, лечение, болезни, уход
Бактериологическое исследование качества и безопасности колбасных изделий.
При бактериологическом исследовании колбас определяют: общее количество микроорганизмов в 1 г продукта; характер микрофлоры; наличие бактерий группы кишечной палочки, сальмонелл, протея, анаэробов.
Пробы, отобранные для бактериологического исследования, обрабатывают следующим образом.
Колбасные изделия в оболочке помещают на металлическую тарелку, которую тщательно протирают тампоном, смоченным спиртом, и обжигают над факелом. Затем батоны разрезают продольно стерильным (фламбированным) ножом или скальпелем на две половинки, не рассекая противоположной стороны оболочки батона. Пробу снимают путем соскоба или среза фарша с обеих половинок всей поверхности разрезанного батона.
При исследовании поверхности продукта отбирают с различных участков образца 2—3 пробы (толщина среза 0,2— 0,5 см). Пробу с поверхности продукции без оболочки можно отобрать путем смыва. Для этого используют стерильные тампоны, смоченные стерильной водой; смыв производят 2—3 раза с различных участков поверхности образца.
Из отобранных проб (срезов или смывов) составляют среднюю для каждого образца отдельно. Средние пробы переносят в предварительно взвешенные стерильные бюксы, которые затем вновь взвешивают; по разнице массы определяют массу взятого образца.
Массу образца можно определять и объемным методом. Для этого используют специально подготовленные пробирки, на стенке которых, на уровне 10 мл жидкости, наносят черту (нарезка алмазом). В пробирки наливают 8 мл физиологического раствора или воды и стерилизуют. Соблюдая стерильность, небольшие кусочки пробы вносят в пробирки в количестве, обеспечивающем подъем налитой жидкости до нанесенной черты (по нижнему мениску).
Взвешенную пробу переносят в стерильную ступку и тщательно растирают, добавляя стерильный физиологический раствор или стерильную воду с расчетом разведения материала в соотношении 1 : 10.
Пробы продуктов плотной консистенции растирают в ступке, добавляя небольшое количество стерильного песка. При растирании проб вареных изделий мажущейся консистенции (ливерные колбасы и др.) стерильный песок можно не добавлять.
Общее количество микроорганизмов в 1 г продукта. Стерильной градуированной пипеткой берут 0,2 мл из верхнего слоя жидкости и переносят на середину дна стерильной чашки Петри. Затем в нее наливают 12—15 мл расплавленного и охлажденного до 45—50 °С мясо-пептонного агара. Осторожно покачивая чашку, внесенный материал смешивают со средой и равномерно распределяют по всей поверхности. Чашки с посевами помещают в термостат при 37 °С.
Через 48 ч чашки вынимают из термостата и подсчитывают число колоний (в глубине и на поверхности среды). Для определения количества микробов в 1 г продукта общее число колоний умножают на 5 и на степень разведения.
Характер микрофлоры. 0,1 мл взвеси наносят на поверхность мясо-пептонного агара, застывшего в чашках. Внесенную жидкость стерильным стеклянным шпателем равномерно распределяют по всей поверхности среды. Чашки с посевами помещают в термостат при 37 °С.
Через 24 ч чашки с посевами вынимают из термостата и определяют характер микрофлоры, просматривают колонии при помощи лупы или под малым увеличением микроскопа. Из колоний, подозрительных на кишечную палочку или патогенную микрофлору, приготавливают мазки и окрашивают их по Граму.
Бактерии группы кишечной палочки и сальмонеллы. 0,1 мл взвеси наносят на поверхность элективной среды (Эндо или Левина), застывшей в чашках. Внесенную жидкость равномерно распределяют по всей поверхности среды. Чашки с посевами помещают в термостат при 37 °С.
Через 24—36 ч чашки с посевами вынимают из термостата и просматривают посевы для того, чтобы определить наличие бактерий группы кишечной палочки и сальмонелл. На фуксинсульфитном агаре (среде Эндо) бактерии группы кишечной палочки образуют темно-красные колонии с металлическим блеском; паратифозные бактерии — круглые прозрачные или полупрозрачные с голубоватым оттенком.
На среде Левина бактерии группы кишечной палочки образуют черные колонии, окруженные светлой зоной или ободком; паратифозные бактерии растут в виде прозрачных нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний.
Из подозрительных колоний приготовляют мазки, окрашивают их по Граму и исследуют на подвижность. Дальнейшую идентификацию бактерий этой группы проводят в соответствии с действующим ГОСТом.
Присутствие протея. Посев материала выполняют по методу Шукевича. 0,1 мл взвеси или небольшой кусочек подготовленной пробы вносят в конденсационную воду скошенного мясо-пептонного агара, не касаясь поверхности среды, и помещают в термостат при 37 °С.
Через 18—24 ч посевы просматривают. Обращают внимание на образование ползучего вуалеобразного налета с голубоватым оттенком. Наличие палочки протея подтверждают микроскопией посева и обнаружением грамотрицательных, активно подвижных палочек.
Присутствие анаэробов. 2—3 мл взвеси вносят в две пробирки с предварительно прокипяченным и быстро охлажденным до комнатной температуры печеночным бульоном (налитым на 2/3 высоты пробирки). Перед помещением в термостат одну из пробирок вновь прогревают при 80 °С в течение 20 мин.
Посевы инкубируют 5 сут при 37 °С. При просмотре посевов обращают внимание на помутнение, газообразование или другие изменения в печеночном бульоне. При подозрении на наличие микробов посев микроскопируют и делают пересев в расплавленный и охлажденный до 50 °С мясо-пептонный агар, добавляя 2 % глюкозы. Агар налит в пробирку на 2/3 ее высоты. По образованию колоний в глубине этой среды и по газообразованию судят о наличии анаэробной микрофлоры, идентификацию которой проводят в соответствии с действующим ГОСТом.
Выделение чистых культур микроорганизмов
Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий – обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной диагностике инфекционных болезней, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и, в целом, при любой работе с микроорганизмами. Исследуемый материал (гной, мокрота, фекалии, кровь и другой материал от больных; вода, почва, воздух, пищевые продукты, трупы животных и человека, переносчики) обычно содержит ассоциации микробов.
Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, то есть производится его идентификация.
Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп.
1. Метод Пастера – последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).
2. Метод Коха («пластинчатые разводки») – последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-50 0 С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и, в дальнейшем, при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.
3. Метод Шукевича – применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева. Пересевая верхние края культуры можно получить чистую культуру.
4. Метод Дригальского – широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном. Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга. Через 1-7 сут выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.
5. Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведения исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50 0 С агаризированной питательной среде. Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды. Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов. Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды. Для извлечения изолированных колоний анаэробов, пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов (например, среду Китта-Тароцци). Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.
6. Метод Хангейта – когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (строгие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта. Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку, среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.
7. Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор – прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.
Выделение чистой культуры по Щукевичу
Для посева берут свежеприготовленную питательную среду с конденсатом. Исследуемый материал забирают петлей и вносят его осторожно, соблюдая правила асептики, не касаясь среды и стенок, в конденсационную воду. Бактерии с высокой подвижностью «выползают» на влажную поверхность скошенного агара.
Методика пересева из колоний на скошенный агар и МПБ
а) Пересев из колоний на скошенный агар
Приоткрывают крышку чашки, прокаленной остуженной петлей снимают часть отдельной колонии, открывают пробирку со стерильным скошенным агаром, держа ее в левой руке в наклонном положении, так, чтобы можно было наблюдать поверхность среды. Переносят петлю с культурой в пробирку, не прикасаясь к стенкам, растирают по питательной среде, скользя по поверхности от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи до верхушки среды – посев штрихом. Пробирку закрывают и, не выпуская из рук, подписывают название посеянного микроба и дату посева.
б) Пересев из колонии на мясо-пептонный бульон
Техника пересева на МПБ в основном такая же, как и при посеве на плотную среду. При посеве на МПБ петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенку сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый стерильной пастеровской или градуированной пипеткой, вливают в питательную среду.
Методические указания к практической работе
Выделение отдельных видов бактерий из исследуемого материала является одним из этапов любого бактериологического исследования.
Обычно для выделения чистой культуры затрачивают 3-4 дня, но в некоторых случаях это время удлиняется, например, для выделения туберкулезных бактерий нужно 4-6 недель.
Посев исследуемого материала. Прокаленной остуженной петлей берут материал из пробирки (задача №. ) и распределяют по поверхности среды петлей, нанося параллельные штрихи на расстоянии 0,4-0,6 см один от другого, от одного края чашки к другому, держа петлю плашмя, чтобы не поцарапать питательную среду. Чашки подписывают (название материала, фамилия, дата посева) со стороны дна и помещают в термостат дном кверху, чтобы капельки конденсата, образующиеся на крышке, не стекали на среду и не размывали посевы.
Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Так как материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырастает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии, очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их. Прежде всего, изучают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет; полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).
Биологические способы (метод Шукевича, метод прогревания, бактериостатический метод, метод обогащения, метод заражения лабораторных животных)
Метод Шукевича:клетки бактерий (протея), характеризующиеся скользящим типом движения, засеянные в конденсационную жидкость свежеприготовленного скошенного агара, поднимаются («всползают») по поверхности среды и разрастаются далеко за зону внесения посевного материала;
Метод прогревания:позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 мин. (При этом погибают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают);
Метод обогащения.Исследуемый материал засевают на элективные питательные среды, способствующие росту определенного вида микроорганизмов.
Метод заражения лабораторных животных:основан на способности некоторых бактерий быстро размножаться в организме чувствительных к ним лабораторных животных (биопроба); применяют в целях выделения и идентификации патогенных микроорганизмов и отделения их от сапрофитной флоры; для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции виды животных или сорта растений, после появления у зараженных организмов признаков болезни их убивают и производят посев органов и тканей на питательные среды. При выделении и изучении облигатных паразитов этот метод является основным и единственным.
4.Этапы выделения чистой культуры аэробов:
I-ый этап – микроскопическое изучение исследуемого материала и посев (например, методом Дригальского):
(1 этап исследования) в стерильную посуду (пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. Его изучают по внешнему виду, консистенции, цвету, запаху и другим признаками, готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом. В некоторых случаях (острая гонорея, чума) на этом этапе можно поставить предыдущий диагноз, а кроме того, подобрать среды, на которые будет засеваться материал. Посев проводят бактериологической петлей (применяется чаще всего), с помощью шпателя по методу Дригальского, ватно-марлевым тампоном. Чашки закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оптимальной температуре (37 °С) на 18-48 ч.
Цель этапа – получить изолированные колонии микроорганизмов.
II- ой этап – макро- и микроскопическое изучение выросших колоний и отсев изолированных колоний для накопления чистых культур:
Чашки тщательным образом рассматривают и изучают изолированные колонии, которые выросли на поверхности агара. Обращают внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие признаки.
Характеристика колоний – важна составная часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии.
Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают по методу Грамма для изучения морфологических и тинкториальних свойств возбудителей, исследуют подвижность бактерий в “висячей” или “раздавленой” капле. Эти признаки имеют чрезвычайно большое диагностическое значение при характеристике отдельных видов микроорганизмов.
Остатки исследуемых колоний осторожно, не касаясь других, снимают из поверхности среды и засевают на скошенный агар или на секторы чашки Петри с питательной средой для получения чистой культуры. Пробирки или чашки с посевами помещают в термостат при оптимальной температуре на 18-24 ч.
III-ий этап – изучение морфологических, тинкториальных и культуральных свойств чистых культур и посев их для изучения сахаролитических (на среды Гисса) и протеолитических свойств (на МПБ).
(3 этап исследования) изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию.
Сначала обращают внимание на особенности роста микроорганизмов на среде и делают мазок, окрашивая его по методу Грамма, с целью проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размеров и тинкториальних свойств, делают вывод, что культура чиста. В некоторых случаях уже по внешнему виду и особенностям роста можно сделать вывод про вид выделенных возбудителей (морфологическая идентификация). Определения вида возбудителей поих культуральным признакам- культуральная идентификация.
Однако этих исследований недостаточно, чтобы сделать окончательный вывод о виду выделенных микробов. Потому изучают биохимические свойства бактерий. Чаще всего исследуют сахаролитические, протеолитические, пептолитические, гемолитические свойства, образования ферментов декарбоксилаз, оксидазы, каталазы, плазмокоагулазы, ДНК-азы, фибринолизина, восстановление нитратов в нитриты и тому подобное. Для этого существуют специальные питательные среды, которые засевают микроорганизмами (пестрый ряд Гисса, МПБ, свернутая сыворотка, молоко и др.).
Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Студалл.Орг (0.004 сек.)
Техника пересева микробной культуры
Выращивание культур
После завершения посева необходимо подписать пробирки соответствующими номерами и поставить в один штатив. Все штативы и чашки с посевами ставят на лоток и только в нем переносят к термостату. Инкубация посевов в термостате при 37°С обычно занимает 18-20 часов. Чашки Петри с посевами помечают со стороны дна и кверху дном ставят на полку термостата, чтобы образовавшиеся капли конденсата с крышки не попали на посев.
В процессе термостатирования на средах вырастает микробная культура. Для дальнейшего изучения ее и выделения чистой культуры, то есть микробов одного вида, применяют различные методы пересева.
В пробирки, штрихом на скошенный агар. С чашки Петри с культурой, бактериальной петлей, с соблюдением правил асептики, легким скользящим движением, не травмируя поверхность агара, снимают часть изолированной колонии. Затем вносят бак.петлю с культурой в пробирку со скошенным агаром до границы конденсата и проводят зигзагообразные движения снизу вверх по поверхности агара.
Нельзя касаться стенок пробирки бактериальной петлей и погружать ее в агар. Бак.петля должна скользить по поверхности среды. На всех этапах пересева необходимо соблюдать правила асептики.
В пробирки, уколом в столбик агара. Бактериальной петлей с микробной культурой прокалывают столбик агара и резким движением вынимают петлю по уколу.
В пробирки, в комбинированный столбик. Для изучения ферментативной активности микробов проводят комбинированный посев в среду, разлитую высоким столбиком со скошенной частью. Культуру засевают зигзагообразными движениями по скошенной части от конденсата, а затем — уколом в центр столбика.
В пробирку с жидкой средой пересев проводят так же, как первичный посев.
Из пробирки в пробирку. При обучении этот пересев выполняют в два этапа: сначала забирают культуру из пробирки, а затем пересевают ее на питательную среду в другой пробирке, соблюдая правила асептики. Более опытные лаборанты сеют одновременно, держа в левой руке две пробирки вместе.
При пересевах на скошенный агар в пробирках, их располагают посевной поверхностью кверху.
В чашки Петри на секторы. Чашку Петри со стерильной плотной питательной средой со стороны дна расчерчивают на секторы. Пересев культуры производят зигзагообразными движениями от края сектора к центру. При этом нужно следить, чтобы штрихи не заходили на соседний сектор.
Посев газоном (капельным методом). Для пересева культура должна находится в жидкой среде. В стерильную пустую чашку Петри вносим пипеткой определенный объем, обычно 1 мл микробной культуры. Заливаем чашку остуженным до 45°С МПА (10-12 мл) и перемешиваем легким покачиванием и вращением чашки. Оставляем чашку на столе до застывания среды. Можно предварительно расплавленную и остуженную до 45°С агаризованную среду внести в пробирку с культурой, а затем взвесь быстро вылить на дно чашки Петри и оставить до застывания.
Посев газоном. Культуру в жидкой среде объемом 1 мл наносят пипеткой на поверхность агаризованной среды в чашке Петри и равномерно распределяют легким покачиванием чашки, далее чашку наклоняют и пипеткой удаляют избыток культуры. Пипетку с культурой помещают в склянку с дезинфицирующим раствором.
Посев по методу Шукевича. Определяют присутствие в материале протея. Берут 0,1 мл взвеси материала и не касаясь поверхности агара (т. е. повернув скошенную часть вверх) засевают в конденсационную воду. При наличии протея после термостатирования на поверхности скошенного агара появляется ползучий, вуалеобразный рост микробов.
Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет