приготовление мясо пептонного агара
Приготовление мясо-пептонного агара.
К 100 мл мясного бульона добавляют 1 % пептона Пептон- это продукт ферментативного гидролиза белков. Добавляют пептон в среду для увеличения ее питательности, для уплотнения среды в нее добавляют от 2 до 4 % агар-агара
Питательная среда д.б. слабокислой по отношению к цитоплазме микроорганизмов, которые будут выращиваться в ней. Для этого в среду добавляют 0,5% поваренной соли. Реакция среды от 7,0 до 7,4. После введения агар-агара смесь прогревают до неполного студнеобразования.
Приготовление мясо-пептонногожелатина.
Дня изучения биохимических признаков микроорганизмов пользуются дифференциально-фагностическими средами. Примером таких сред могут служить среды Гисса. Их применяют для изучения способности м.о. ферментировать углеводы.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ:
Приготовить 100 мл МПА:
2. В колбу наливают 100 мл МБ. Взвешивают 2 г. пептона. 0,5 г. агар-агара. Все это помещают в колбу с мясным бульоном.
3. Колбу ставят в кастрюлю с горячей водой и содержимое колбы подогревают до тех пор пока полностью не расплавится агар-агар и среда не станет однородной. Затем добавляют соды (до слабощелочной реакции по лакмусу).
4. Расплавленную среду разливают в пробирки по 10 мл.
5. Готовят ватные пробирки, обтягивают их марлей и закрывают пробки с приготовленной питательной средой.
6. Пробирки с МПА помещают в корзины. Сдают лаборанту для стерилизации.
Классификация питательных сред
По составу питательную среду подразделяют на 2 группы: натуральные среды неопределенного состава и синтетические среды.
Натуральными обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный неопределенный хим. состав. Основой таких сред являются различные части зеленых растений, животные ткани. солод, дрожжи, фрукты, овощи. Большинство из них используется в виде экстрактов или настоев. Однако среды с неопределенным составом малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку они не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды, а с другой стороны выявить, какие вещества образуются по ходу развития м.о. Это связано с тем, что состав натуральных питательных сред очень сложен, кроме того он не является постоянным. Натуральные среды неопределенного состава используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. К числу сред неопределенного состава относят и так называемые среды «полусинтетические». В их состав наряду с известными хим. соединениями входят вещества неопределенного состава Такие среды находят широкое применение в пром. микробиологии для получения аминокислот, витаминов и антибиотиков. В качестве примера таких сред можно назвать: мясопептонная среда, в состав которой одновременно с мясным экстрактом и пептоном входит поваренная соль, фосфорнокислый каши, иногда глюкоза или сахароза, картофельные среды с глюкозой или пептоном.
По назначению : различают элективные и дифференциально-диагностические среды
Элективные среды обеспечивают развитие преимущественно одного вида м.о. или группы родственных микроорганизмов (менее пригодны или совсем не пригодны для развития других). Такие среды применяют главным образом для выделения.
Микроорганизмов из мест их естественного обитания, для получения накопительных культур.
Дифференциально-диагностические среды: это такие среды, которые позволяют по возможности очень быстро отличить (дифференцировать) одни виды м.о. от других. Их состав подбирается с таким расчётом, чтобы он позволил чётко выявить наиболее характерные свойства данного вида м.о. Нередко это достигается введением в среды специальных красителей-индикаторов.
По физическому состоянию среды разделяют на жидкие, плотные и сыпучие. Для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, а также для накопления их биомассы или продуктов обмена наиболее удобно применять жидкие среды. Плотные среды используют для выделения чистых культур. В промышленной биологии применяют так называемые сыпучие среды. К ним относятся разваренное пшено, пропитанное питательным раствором.
Вопросы для самоконтроля:
1. Что принято считать питательными средами?
2. Как классифицируют их по агрегатному состоянию?
3. Как делятся питательные среды по назначению? В каких случаях удобнее применять те или иные среды?
4. Какие среды называют дифференциально-диагностическими?
5. Как готовят питательные среды? Какие студнеобразователи чаще всего применяют?
6. Что входит в состав МПА? Как его готовят?
7. Чем отличается МПА от МПЖ?
1. Оформление отчета по лабораторному занятию.
2. Подготовиться к защите лабораторного занятия.
Приложение 4. Приготовление питательных сред
Приготовление питательных сред
Среды для определения общей бактериальной обсемененности
1. Мясо-пептонный бульон. Освобожденное от костей, жира и сухожилий говяжье или конское мясо пропускают через мясорубку и заливают холодной водопроводной водой из расчета 1 л воды на 500 г мяса. Смесь водопроводной воды с фаршем медленно нагревают до кипения и кипятят в течение 1,5 часов. Небольшое количество (до 5 л) можно кипятить на открытом огне, часто помешивая, чтобы не произошло пригорания частичек мяса. Большое количество лучше кипятить в котлах с паровой рубашкой. Для определения готовности мясной воды фильтруют сначала небольшое количество ее в пробирку через бумажный фильтр, если жидкость прозрачная, вода готова. Затем жидкость сцеживают через полотно, сюда же отжимают сок из вареного мяса, доливают кипяченой водой до первоначального объема, разливают в чистую посуду (колбы, бутылки) и стерилизуют 20 мин в автоклаве при температуре 120°С. Из полученной мясной воды готовят мясо-пептонный бульон. К 1 л мясной воды добавляют 10 г пептона, 5 г NaCl, устанавливают реакцию до рН 7,0-7,2, кипятят, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в чистую посуду и стерилизуют 20 мин в автоклаве при температуре 120°С. В случае выпадения осадка в мясо-пептонном бульоне его вторично фильтруют с последующей стерилизацией.
2. Мясо-пептонный агар. К мясо-пептонному бульону прибавляют 1,5% мелко нарезанного агара. Ставят на слабый огонь для растворения. Устанавливают реакцию до рН 7,0-7,2, кипятят 12-15 мин, фильтруют через вату, добавляют 1% глюкозы, разливают в колбы или пробирки, стерилизуют при температуре 120°С в течение 20 мин.
3. Сухой питательный агар выпускается Дагестанским научно-исследовательским институтом питательных сред.
Среды и реактивы для выявления бактерий кишечной группы
1. Концентрированная среда Эйкмана. В 1 л воды растворяют 100 г пептона, 50 г хлористого натрия, смесь нагревают до кипения, фильтруют, прибавляют 100 г глюкозы, устанавливают рН 7,4-7,6, разливают по 10 см3 в пробирки. Среду стерилизуют текучим паром 30 мин, считая с момента когда термометр покажет температуру 100°С. Стерилизация текучим паром должка производиться 3 дня подряд. В промежутках между стерилизациями среда должна находиться в помещении с температурой не ниже 16°С.
2. Среда Эндо. 100 см3 мясо-пептонного агара (рН 7,4) расплавляют на водяной бане, охлаждают до 70°С и прибавляют 1 г химически чистой лактозы, предварительно растворенной в небольшом количестве стерильной прокипяченной дистиллированной воде.
В отдельных пробирках приготовляют:
а) 2-3 см3 спиртового насыщенного раствора основного фуксина;
б) 10 см3 10%-ного водного раствора сернокислого натрия или 10 см3 20%-ного водного раствора кристаллического сернокислого натрия.
В стерильную пробирку отмеряют 1 см3 раствора фуксина и прибавляют раствор сернистокислого натрия до обесцвечивания фуксина. Приготовленную смесь вливают в растопленный агар, хорошо перемешивают (избегая образования пены) и разливают по чашкам.
Горячий агар имеет бледно-розовый цвет, при застывании становится бесцветным.
3. Сухая среда Эндо выпускается Дагестанским научно-исследовательским институтом питательных сред.
4. Среда Гисса. К 100 см3 дистиллированной воды добавляют 1 г пептона, 0,5 химически чистого хлористого натрия, 0,5 г углевода и 1 см3 индикатора Анредэ. Устанавливают рН 7,0. Среду разливают в пробирки по 5 см3 с поплавками и стерилизуют при 110°С 20 мин. Среда должна быть бесцветной или соломенно-желтого цвета без розового оттенка.
Можно использовать сухие среды Гисса: сухой препарат с индикатором ВР, глюкозой.
5. Индикатор Андредэ. К 100 см3 дистиллированной воды добавляют 0,5 г кислого фуксина и 16,4 см3 1%-ного раствора едкого натрия. Стерилизуют при 110-112°С в течение 5 мин и хранят в темноте.
6. Реактивы для окраски по Граму.
а) 1%-ный водный раствор метилового фиолетового
б) раствор йода по Бурке: 100 см3 дистиллированной воды, 2 г йодистого калия, 1 г йода.
в) 0,5%-ный водный раствор сафранина.
Среды для выявления плесеней
Агаризованное солодовое сусло. К 1000 см3 солодового сусла (7-8%) прибавляют 20 г расплавленного на водяной бане или в аппарате Коха агара. Смесь фильтруют через гигроскопическую вату или фильтровальную бумагу. Фильтрат разливают по стерильным колбам и стерилизуют 15 мин при температуре 115°С или 3 дня по 30 мин в аппарате Коха при температуре 100°С. Среду можно приготовить, используя вместо сусла солодовый экстракт.
Агаризованное солодовое сусло должно иметь рН 5,6-5,8.
Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
Приготовление питательных сред
Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления мясо-пептонных сред используют мясной бульон, который получают следующим образом: 500 г мелко изрубленного свежего мяса без костей, жира и сухожилий заливают в эмалированной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50°С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 50—55°С. Мясо отжимают, экстракт процеживают через марлю со слоем ваты, кипятят 30 мин для свертывания коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз через марлю с ватой, второй — через бумажный фильтр). Фильтрат доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин (пробки колб закрывают сверху колпачками из бумаги). Ватные пробки должны быть плотными, так как они служат фильтром, препятствующим проникновению бактерий из воздуха после стерилизации.
Мясной бульон может быть использован в любое время для приготовления соответствующих сред. Если их готовят сразу, то предварительная стерилизация мясного бульона не требуется.
Нередко в лабораторных условиях мясной настой кипятят вместе с мясом, затем мясо отжимают. При этом бульон получается хорошего качества. При потребности в мясном бульоне особо высокой питательности во время настаивания мяса с водой добавляют немного пепсина и подкисляют бульон соляной кислотой. Пепсин способствует дополнительной гидролизации белковых соединений мяса, и в результате количество доступных бактериям питательных веществ возрастает. Мясо можно заменить мясным экстрактом (5 г на 1 л среды).
Для приготовления МПБ к 1 л мясного бульона добавляют 5—10 г пептона (первый продукт гидролиза белка) для повышения калорийности среды и 5 г поваренной соли для создания осмотической активности. Среду нагревают до растворения пептона, постоянно помешивая.
Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, приливая 20%-ный раствор Na2CO3 до посинения влажной красной лакмусовой бумажки. Дли проверки рН среды удобно использовать индикатор бромтимолблау: 1—2 капли его смешивают в фарфоровой чашке с каплей бульона. В нейтральной среде бромтимолблау — бутылочно-зеленый, в кислой — желтый, в щелочной — синий.
После установления рН среду снова кипятят 5—10 мин, и белки, свернувшиеся при изменении реакции среды, отфильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульона или осветлив его белком. Для этого свежий яичный белок взбивают с двойным по объему количеством воды и смешивают с охлажденным до 50 °С бульоном. Смесь кипятят, помешивая, на слабом огне 10 мин, затем фильтруют. Прозрачный мясо-пептонный бульон разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин.
Мясо-пептонный агар (МПА). К 1 л МПБ добавляют 15— 20 г агара. Среду нагревают до растворения агара (температура его плавления — 100 °С, затвердевания — 40 °С), устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na2CO3 и через воронку разливают в пробирки (приблизительно по 10 мл агара столбиком для последующего разлива по чашкам Петри и по 5 мл для получения скошенного агара — косяков).
При разливе агара необходимо следить за тем, чтобы края пробирок оставались сухими, иначе пробки прилипнут к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120 °С 20 мин.
Мясо-пептонная желатина (МПЖ).В 1 л МПБ помешают 100—150 г желатины. Температура плавления желатины зависит от ее содержания в среде: в случае 10%-ной концентрации в среде она плавится при 24 °С; в случае 15%-ной — при 25 °С. В летнее время среды готовят, добавляя 15% желатины.
После растворения желатины при осторожном нагревании устанавливают слабощелочную реакцию среды (как для МПБ и МПА), кипятят 5 мин, затем охлаждают до 40—50 °С. Взбитый, с небольшим количеством воды яичный белок вливают в охлажденную желатиновую среду, хорошо взбалтывают и снова нагревают. Среда после выпадения белков в осадок становится прозрачной. Ее фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр, разливают в пробирки и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром, прогревая среду 3 раза по 30 мин каждые 24 ч.
Пивное сусло и сусло-агар. Зерна ячменя замачивают в холодной воде и проращивают при 35 °С. После того как ростки станут вдвое длиннее зерен, последние высушивают до воздушно-сухого состояния (можно при слабом подогревании), получая солод. Для приготовления сусла солод крупно размалывают и смешивают с водой (250 г солода на 1 л воды). Для лучшего выделения фермента амилазы смесь подогревают при 57 °С до исчезновения реакции на крахмал (синего окрашивания с иодом). Пробы на осахаривание крахмала проводят в фарфоровой чашке в капле жидкости.
Сусло процеживают через вату, затем фильтруют через бумажный фильтр. Такое сусло содержит 10—20% сахара. Точное его содержание определяют по плотности раствора при помощи сахариметра. Сусло разбавляют водой до концентрации сахара 6—8% и стерилизуют 30 мин при 115 °С и давлении 0,5 атм. Готовое сусло можно получить на пивоваренном заводе.
Для приготовления сусло-агара к пивному суслу добавляют 2,5—3% агара, кипятят до расплавления, фильтруют через вату и стерилизуют при тех же условиях, как и пивное сусло.
Обезжиренное молоко. Для приготовления питательных сред используют снятое молоко, так называемый обрат, так как жир в молоке неблагоприятно влияет на рост некоторых микроорганизмов. Обрат получают сепарированием молока, нагретого до 34 °С. Можно удалять жир и при отстаивании молока.
При стерилизации следует помнить о том, что молоко нельзя длительное время выдерживать в автоклаве, так как лактоза (молочный сахар), содержащаяся в молоке, может карамелизоваться.
Обезжиренное молоко разливают в стерильные пробирки и выдерживают при 115 °С (давление 0,5 атм) 10 мин. Перед стерилизацией кислотность обрата не должна превышать 22° Тернера, иначе молоко свернется. После стерилизации его выдерживают 3 сут в термостате при 30°С. чтобы спровоцировать развитие спорообразующих и других стойких к нагреванию форм. Через 3 сут пробирки с молоком просматривают и те, в которых развились микроорганизмы, выбраковывают.
При стерилизации в автоклаве иногда возможно побурение молока вследствие карамелизации молочного сахара и пептонизании казеина. При длительной стерилизации на дно пробирки выпадает осадок казеина, который может частично пептонизироваться. Перегретoe побуревшее молоко в качестве среды использовать нельзя.
Дрожжевые среды. Дрожжевая вода. 50—100 г сухих дрожжей разводят в 1 л воды, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение 3 дней ежедневно.
Дрожжевой автолизат. 200 г прессованных дрожжей разводят в 1 л воды; добавляют 2 г Na2HPO4, каплями I н. раствор NaOH (до рH 6,1) и 5 мл хлороформа, выдерживают при 37 °С 2 сут, доводят раствором NaOH до рН 7,4, кипятят 30 мин. фильтруют через бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют при 115 °С 30 мин.
Дрожжевой экстракт. 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 л воды, смесь кипятят 1 ч, трижды отфильтровывают через бумажный фильтр и стерилизуют при 115 °С 30 мин.
Бобовый отвар. 50 г фасоли (лучше белой) заливают 1 л водопроводной воды и варят до готовности так, чтобы бобы не разварились. Полученный отвар фильтруют через вату, добавляют к нему 10 г сахара и доводят до первоначального объема. Устанавливают слабощелочную реакцию среды, разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве 30 мин при давлении пара 1,5 атм.
1 По системе СИ давление принято выражать в паскалях (Па): 1 атм = 1,01325 х 10 5 Па = 0,1 МПа.
Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет
Приготовление мясо-пептонного агара
К 100 мл мясного бульона добавляют 1 % пептона Пептон- это продукт ферментативного гидролиза белков. Добавляют пептон в среду для увеличения ее питательности, для уплотнения среды в нее добавляют от 2 до 4 % агар-агара
Питательная среда д.б. слабокислой по отношению к цитоплазме микроорганизмов, которые будут выращиваться в ней. Для этого в среду добавляют 0,5% поваренной соли. Реакция среды от 7,0 до 7,4. После введения агар-агара смесь прогревают до неполного студнеобразования.
Приготовление мясо-пептонногожелатина.
Дня изучения биохимических признаков микроорганизмов пользуются дифференциально-фагностическими средами. Примером таких сред могут служить среды Гисса. Их применяют для изучения способности м.о. ферментировать углеводы.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ:
Приготовить 100 мл МПА:
2. В колбу наливают 100 мл МБ. Взвешивают 2 г. пептона. 0,5 г. агар-агара. Все это помещают в колбу с мясным бульоном.
3. Колбу ставят в кастрюлю с горячей водой и содержимое колбы подогревают до тех пор пока полностью не расплавится агар-агар и среда не станет однородной. Затем добавляют соды (до слабощелочной реакции по лакмусу).
4. Расплавленную среду разливают в пробирки по 10 мл.
5. Готовят ватные пробирки, обтягивают их марлей и закрывают пробки с приготовленной питательной средой.
6. Пробирки с МПА помещают в корзины. Сдают лаборанту для стерилизации.
Классификация питательных сред
По составу питательную среду подразделяют на 2 группы: натуральные среды неопределенного состава и синтетические среды.
Натуральными обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный неопределенный хим. состав. Основой таких сред являются различные части зеленых растений, животные ткани. солод, дрожжи, фрукты, овощи. Большинство из них используется в виде экстрактов или настоев. Однако среды с неопределенным составом малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку они не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды, а с другой стороны выявить, какие вещества образуются по ходу развития м.о. Это связано с тем, что состав натуральных питательных сред очень сложен, кроме того он не является постоянным. Натуральные среды неопределенного состава используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. К числу сред неопределенного состава относят и так называемые среды «полусинтетические». В их состав наряду с известными хим. соединениями входят вещества неопределенного состава Такие среды находят широкое применение в пром. микробиологии для получения аминокислот, витаминов и антибиотиков. В качестве примера таких сред можно назвать: мясопептонная среда, в состав которой одновременно с мясным экстрактом и пептоном входит поваренная соль, фосфорнокислый каши, иногда глюкоза или сахароза, картофельные среды с глюкозой или пептоном.
По назначению : различают элективные и дифференциально-диагностические среды
Элективные среды обеспечивают развитие преимущественно одного вида м.о. или группы родственных микроорганизмов (менее пригодны или совсем не пригодны для развития других). Такие среды применяют главным образом для выделения.
Микроорганизмов из мест их естественного обитания, для получения накопительных культур.
Дифференциально-диагностические среды: это такие среды, которые позволяют по возможности очень быстро отличить (дифференцировать) одни виды м.о. от других. Их состав подбирается с таким расчётом, чтобы он позволил чётко выявить наиболее характерные свойства данного вида м.о. Нередко это достигается введением в среды специальных красителей-индикаторов.
По физическому состоянию среды разделяют на жидкие, плотные и сыпучие. Для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, а также для накопления их биомассы или продуктов обмена наиболее удобно применять жидкие среды. Плотные среды используют для выделения чистых культур. В промышленной биологии применяют так называемые сыпучие среды. К ним относятся разваренное пшено, пропитанное питательным раствором.
Вопросы для самоконтроля:
1. Что принято считать питательными средами?
2. Как классифицируют их по агрегатному состоянию?
3. Как делятся питательные среды по назначению? В каких случаях удобнее применять те или иные среды?
4. Какие среды называют дифференциально-диагностическими?
5. Как готовят питательные среды? Какие студнеобразователи чаще всего применяют?
6. Что входит в состав МПА? Как его готовят?
7. Чем отличается МПА от МПЖ?
1. Оформление отчета по лабораторному занятию.
2. Подготовиться к защите лабораторного занятия.
Приготовление мясо — пептонного агара (МПА)
К мясо — пептоному бульону добавляют 2% морской водоросли агар-агара, который плавится при 100°С и затвердевает при комнатной температуре. После стерилизации в автоклаве мясо — пептонный агар, разлитый в пробирки, оставляют застыть столбиком или готовят скошенный агар, укладывая пробирки в наклонном положении под углом 20°С.
Питательные среды должны отвечать следующим требованиям:
3. оптимальный показатель рН (для большинства бактерий 7,2-7,6);
5. прозрачность, чтобы был виден рост бактерий;
6. стерильность, чтобы не было других бактерий.
28.Классификация сред.
По происхождению среды подразделяют на естественные (природные), искусственные и синтетические.
-Естественные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, желчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.
-Искусственные среды изготовлены по определённым рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.
-Синтетические среды – содержат определённые химические соединения в точно указанных концентрациях.
По концентрации среды бывают жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие, сухие.
По назначению среды подразделяют на основные (простые: 1%-ная пептонная вода, мясопептонный бульон/агар, бульон/агар Хоттингера и сложные: сахарный бульон/агар, сывороточный бульон/агар, кровяной агар, желчный бульон, желточно-солевой агар); специальные (обогащенные, среды для хранения), элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие, транспортные, накопительные.
-основные (МПА, МПБ) – простые по составу и применяются для культивирования большинства неприхотливых бактерий;
-обогащенные – на основе простых + кровь, сыворотка, асцитическая жидкость и др. Используют для накопления определенной группы бактерий за счет создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто в качестве подобных агентов используют различные красители и химические вещества – соли желчных кислот, тетратионат Na⁺, теллурит K⁺; антибиотики, фуксин, генциановый фиолетовый, бриллиантовый зеленый и др.
-транспортные и консервирующие среды предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов, их применяют для временного сохранения микроорганизмов после взятия исследуемого материала.
29.1) лаг-фаза (англ. lag — запаздывание) — период между посевом бактерий и началом их размножения, продолжительностью 4-5 часов;
Z) фаза логарифмического (экспоненциального) роста — период интенсивного деления бактерий, продолжительностью 5-6 часов;
3) фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток не изменяется, составляя максимальный уровень (М-концентрация);
4) фаза гибели бактерий.
30. Для получения изолированных колоний на практике наиболее часто используют модифицированный метод по Дригальскому (или метод «механического» разобщения). Для этого материал наносят частыми штрихами на поверхность плотной питательной среды в верхней трети чашки. Затем, отступив от основного посева, продолжают посев параллельными частыми штрихами на оставшейся поверхности среды. Подобный метод позволяет получить изолированные колонии и изучать их.
Указанные методы пригодны для посева аэробных и факультативно анаэробных бактерий, а также нестрогих анаэробов.
-Биологический метод получения чистых культур бактерий. Исследуемым материалом заражают лабораторное животное, чувствительное к какому-то одному микроорганизму, содержащемуся в патологическом материале. У животного возникает инфекционный процесс с накоплением возбудителя во внутренних органах, из которых и выделяют чистую культуру.
-Культуральный метод получения чистых культур бактерий. Используется только для бактерий рода Proteus, обладающих «ползучим» характером роста из-за наличия большого количества жгутиков. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду у основания скошенного МПА. Протей «выползает» на скошенную часть среды, в то время как остальные бактерии растут на месте посева.
-Физический метод получения чистых культур бактерий. Используется для получения чистых культур спорообразующих бактерий. Исследуемый патологический материал подвергают кипячению в течение 5 минут для уничтожения не образующих спор ассоциантов, после чего засевают материал на питательные среды.
-Химический метод получения чистых культур бактерий. Используется для получения чистых культур кислотоустойчивых микроорганизмов, главным образом, микобактерий. Исследуемый патологический материал обрабатывают 5%-м раствором серной кислоты, под действием которого погибают некислотоустойчивые ассоцианты. После нейтрализации кислоты материал засевают на питательные среды
-Метод механического разобщения для получения чистых культур бактерий.
а) Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й – минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на одной из чашек вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры микроорганизма.
б) Рассев петлей (посев штрихами). Метод принципиально не отличается от предыдущего, но более экономичен. Берут одну (. ) чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки.
31. Анаэробы. Посевы анаэробных бактерий в жидких средах заливают вазелиновым или другим маслом. При использовании плотных сред посевы культивируют в специальных устройствах — анаэростатах (откуда откачивают воздух) либо заливают посевы тонким слоем агара. Анаэробные условия можно создать химическим путём, поместив посевы в эксикаторы, на дно которых заливают щелочной раствор пирогаллола, поглощающего кислород. Также можно использовать методы Фортнера, Цейсслера и Вёйнберга.
Метод Фортнера. Посевы проводят на чашку Петри с толстым слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину засевают культуру аэробных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробов, а затем (после поглощения кислорода) — рост анаэробов.
Метод Цейсслера используют для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого проводят посев на среду Китта-Тароцци, прогревают 15 мин при 80°С (для уничтожения вегетативных форм), заливают вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч. Затем проводят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования подозрительные колонии изучают и отсевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).
Метод Вёйнберга используют для получения чистых культур строгих анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, вносят в сахарный бульон. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом материал переносят в узкие пробирки (трубки Виньяля) с сахарным МПА, погружая пастерку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают холодной водой, что позволяет зафиксировать отдельные бактериальные клетки в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют, и изучают выросшие колонии. При обнаружении подозрительной колонии на её месте делают распил, колонию быстро отбирают и засевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).
32. На первом этапе для получения изолированных колоний делают посев исследуемого материала, как правило, на плотные питательные среды, выбор к-рых обусловливается свойствами предполагаемого возбудителя. Применяют по возможности элективные среды, на к-рых растет только данный вид бактерий, или дифференциально-диагностические среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов.
На втором этапе проводят исследование колоний бактерий, происходящих от одной бактериальной клетки и выросших на плотной питательной среде (колония и является чистой культурой возбудителя).
Третий этап заключается в идентификации выделенной чистой культуры возбудителя и определении его чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам. Идентификацию выделенной бактериальной культуры осуществляют по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным, токсигенным свойствам.